Processing and characterization of tailor-made superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO-NPs) for pharmaceutical applications

Abstract

Das Forschungsgebiet der Eisenoxid-Nanopartikel, auch bekannt als Magnetit, wächst sehr schnell. Diese Nanopartikel sind Kernbestandteil der Nanotechnologie, die heute eine Multimilliarden-Dollar-Industrie darstellt. Das weltweit zunehmende Interesse der verschiedenen Forscher an Nanopartikeln beruht auf ihren einzigartigen und vielseitigen physikalischen und chemischen Eigenschaften, insbesondere auf sogenannten „quantum size effects“. Eine einzigartige Klasse von speziell hergestellten Eisenoxid-Nanopartikeln sind superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO-NP). Dieser Superparamagnetismus tritt in magnetischen Materialien auf, wenn die Partikelgröße 30 nm unterschreitet. Er bietet die Möglichkeit, die Partikel nach Applikation in einem Prozess durch magnetische Felder zu beeinflussen. Verschiedene industrielle und biomedizinische Anwendungen hängen von der Stabilität der SPIO-NP unter verschiedenen Bedingungen ab. Es ist interessant, dass unter allen anderen magnetischen Nanopartikeln nur Eisenoxid-Nanopartikel in biomedizinischen Anwendungen wie Hyperthermie, Magnetresonanztomographie (MRT) und zielgerichteter Wirkstofffreisetzung aufgrund ihrer hervorragenden magnetischen Eigenschaften verwendet werden und bei der Entfernung des angelegten Magnetfeldes komplett ihre Magnetisierung verlieren. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit ist es, theoretisch fundierte Beschreibungen für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen (insbesondere in der Wirkstofffreisetzung) mit Methoden aus der mechanischen Verfahrenstechnik zu entwickeln: Analyse und Optimierung des Herstellungsprozesses von biokompatiblen SPIO-NP, gekennzeichnet durch die Merkmale (a) die Partikelgröße der SPIO-NP zwischen 10-125 nm, die durch Co-Präzipitationsverfahren synthetisiert wurden, (b) die Modifikationen und Funktionalisierung der Partikeloberflächen und -kerne, für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und den Transport relevanter pharmazeutischer Wirkstoffe sowie (c) Optimierung der Kern- und Oberflächenmodifizierung und -funktionalisierung mit erstens: Chemischen Substanzen zur Maskierung der SPIO-NP zur Überwindung der BHS (Tween 80, Dextran 70.000 und DEAE-Dextran) und zweitens: Fluoreszenzmarker - Rhodamin 123 (Partikel im Blutstrom, während der Durchquerung der BHS) und Propidiumiodid (PI) (zum Nachweis der Nanopartikel im Zellgewebe). Eine weiteres Ziel des Projekts bestand darin, detaillierte Kenntnisse über die konzentrationsabhängige in vitro- und in vivo-Toxizität der synthetisierten beschichteten SPIO-NP zu erlangen, insbesondere wenn sie nach ihrer Interaktion mit Gehrinzellen (C6-Zellen), die aus Ratten-Glia-Tumoren extrahiert wurden, mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden. SPIO-NP wurden bisher nicht als Modell für BHS in den retinalen Ganglienzellen untersucht, indem konfokale Neuroimaging in vivo verwendet wurde. Die SPIO-NP wurden mittels Co-Präzipitationsmethode aus Eisen- und Eisensalzlösung mit einem Molverhältnis von 2:1 in deionisiertem Wasser (Deionat) in einem Dreihals-Rundboden-Glasreaktor unter kräftigem Rühren synthetisiert. Die Tenside (Dextran 70.000, DEAE-Dextran und Tween 80) wurden im Deionat separat in einem Glasbecher gelöst und anschließend in den Dreihals-Reaktionskolben gegeben. Die Reaktionstemperatur wurde auf 40-100 °C eingestellt, bei der NaOH oder 25%ige NH3-Lösung schnell in den Glasreaktor gespritzt wurde, um den pH- Wert der Lösung zu erhöhen. Die so entstandene schwarze Suspension, wies auf die Magnetitbildung hin. Die Reaktion wurde bei einer Rührerdrehzahl von 400 U/min bis 1000 U/min (Umfangsgeschwindigkeit von 1,21 m/s bis 3,03 m/s) bei gleicher Temperatur für eine Stunde durchgeführt. Die Nanopartikelsynthese wurden dann 10 Minuten lang mithilfe von Ultraschall untersucht. Für die Markierung mit Fluoreszenzmarker wurde der Fluoreszenzfarbstoff in Deionat gelöst und anschließend mit der stöchiometrischen Menge an Eisenoxid-Nanopartikeln und anschließendem Magnetrührer eingebracht. Die Nanopartikel wurden hinsichtlich Größe, Größenverteilung, Zetapotenzial und Morphologie charakterisiert. Die in vitro Zytotoxizität und relative Zelllebensfähigkeit wurde mit Hilfe des MTT kolorimetrischen Assays gemessen, wenn SPIO-NP den C6-Gliomzellen mit unterschiedlichen Inkubationszeiten ausgesetzt wurden. Für die in vivo zytotoxische Studie wurde die zelluläre Aufnahme durch Injektion verschiedener Variationen von fluoreszierenden SPIO-NP in Tiergruppen (Ratten) durchgeführt: retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen, intravitreale SPIO-NP Injektion, in vivo konfokale Neuroimaging und ex vivo konfokale Bildgebung. Die Ergebnisse zeigen, dass die synthetisierten SPIO-NP, die mit Tween 80, Dextran 70.000 und DEAE-Dextran beschichtet sind, im Größenbereich von 10~100 nm liegen und sowohl mit positivem als auch negativem Zetapotential vorkommen. Die Verwendung von Tween 80 als Oberflächenbeschichtung führt zu einer schmaleren Größenverteilung und einem höheren Zetapotenzial. Die Überlebenswahrscheinlichkeit der Zellen bei SPIO-NP-Exposition war bei einer DEAE-Dextran-Beschichtung mit 16 Stunden Inkubationszeit größer. Wenn die Inkubationszeit auf 24 Stunden erhöht wurde, war die Überlebenswahrscheinlichkeit signifikant reduziert. Die niedrigste Überlebenswahrscheinlichkeit wurde für Tween 80 beschichtete SPIO-NP gemessen. Für den Fall von beschichteten SPIO-NP, die gleichzeitig mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wurde die maximale Überlebenswahrscheinlichkeit mit Propidiumiodid für die Dextran-70.000-Beschichtung ermittelt. Die Akkumulation von fluoreszierenden SPIO-NP in Somazellen wurde durch die konfokale Bildgebung bestätigt. In-Vivo-Untersuchungen ergaben, dass wir für höhere Dosierung von SPIO-NP hellere Fluoreszenzsignale erhielten, verglichen mit jenen Kontrolltieren, die nur Träger-NP erhielten. Bei niedrig dosierten Injektionen waren die SPIO-NP gleichmäßig über die Netzhaut verteilt.

The field of iron oxide nanoparticles also known as magnetite is growing very rapidly and these nanoparticles are core component of nanotechnology which is a multi-billion dollars industry today. This globally increasing interest of various researchers in ‘nano’-objects is due to their unique and versatile physical and chemical properties, so-called quantum size effects. A unique class of iron oxide nanoparticles is superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO-NPs) and this superparamagnetism phenomenon occurs in magnetic materials when they comprised of the extremely small size below than 30 nm. SPIO-NPs are a very special class of engineered nanoparticle that can be influenced by an external magnetic field when applied. Various industrial and biomedical applications depend on the stability of SPIO-NPs under a number of different conditions. It is an interesting fact that among all other magnetic nanoparticles, only iron oxide nanoparticles are under use in biomedical applications such as hyperthermia, magnetic resonance imaging (MRI), and targeted drug delivery due to their excellent magnetic properties and have zero magnetization on the removal of the applied magnetic field. The objectives of the present doctoral work were to develop theoretically based descriptions for use in biomedical applications (especially in drug delivery) with simplified assumptions used in mechanical process engineering. Analysis and optimization of the production process of biocompatible SPIO-NPs which characterized by the features (a) the particle size of the SPIO-NPs between 10-125 nm synthesized by a co-precipitation method (b) the modifications and functionalization in particles core and surface aiming SPIO-NPs passing the blood-brain barrier (BBB) and transporting relevant pharmaceutical compounds (c) systematic studies to optimize the process of core and surface modification and functionalization (particle core, surface coatings, and loadings) with (1) chemical compounds for masking the SPIO-NPs to overcome the BBB-Tween 80, Dextran 70,000, and DEAE-Dextran (2) fluorescence markers – rhodamine 123 (particles in blood stream, during crossing the BBB), and propidium iodide (PI) (to prove the NPs in the cell tissue). Another challenge of the project was to obtain the detailed knowledge about the concentration-dependent in vitro and in vivo toxicity of the synthesized coated SPIO-NPs and especially when labelled with fluorescent dyes after their interaction with the brain cells (C6 cells) extracted from rat glial tumor. SPIO-NPs were not studied before as a model of BBB in the retinal ganglion cells by using in vivo confocal neuroimaging. SPIO-NPs were synthesized via a co-precipitation method of ferric and ferrous salts solution with 2:1 molar ratio in deionized (DI) water in a three-neck round bottom glass reactor under vigorous stirring. Surfactants (Dextran 70,000, DEAE-Dextran, and Tween 80) were solubilized in DI water separately in a glass beaker and then added into the three-neck reaction flask. The reaction temperature was adjusted to 40-100 °C at which NaOH or 25% NH3 solution was quickly syringed into the glass reactor to increase the solution pH. A black color suspension was thus formed indicating the magnetite formation. The reaction was carried out for nucleation and growth of nanoparticles at 400 rpm to 1000 rpm (stirrer tip speed from 1.21 m/s to 3.03 m/s) under the same temperature for one hour. Nanoparticles syntheses were then probed to sonication for 10 minutes. For labelling with fluorescence marker, fluorescence dye was dissolved in DI water and then introduced with the stoichiometric amount of iron oxide nanoparticles followed by a magnetic shaker. Afterward, the nanoparticles were separated from the unlabeled solution by centrifugation and re-dispersed in DI water. The nanoparticles were characterized for size, size distribution, zeta potential, and morphology. The in vitro cytotoxicity and relative cell viability was measured using MTT colorimetric assay when SPIO-NPs were exposed to C6 glioma cells at different incubation times. For in vivo cytotoxic study, cellular uptake was performed by injecting different variations of fluorescent SPIO-NPs in animal (rat) groups for retrograde labelling of retinal ganglion cells, intravitreal SPIO-NPs injection, in vivo confocal neuroimaging, and ex vivo confocal imaging. The results show that synthesized SPIO-NPs coated with Tween 80, Dextran 70,000, and DEAE-Dextran were in the size range of 10~100 nm with positive or negative zeta potentials. But the size distribution using Tween 80 as the surface coating material is narrower and also has higher zeta potentials. The cell viability of SPIO-NPs was greater in the case of DEAE-Dextran coated SPIO-NPs with16 hours’ incubation. When incubation time was increased to 24 hours, then the cell viability was decreased. The least cell viability was measured for the case when SPIO-NPs were coated with Tween 80. For the case of coated SPIO-NPs simultaneously labelled with fluorescent dyes, maximum cell viability was recorded with propidium iodide for Dextran 70,000 coated SPIO-NPs. The accumulation of fluorescent SPIO-NPs in cell soma was confirmed by the confocal photographs. In vivo investigations revealed that for higher dosage of SPIO-NPs, we obtained brighter fluorescence signals as compared to those control animals which only received vehicle injections. SPIO-NPs were evenly distributed over the retina when animals were injected low dosage injections.