Bottom-up construction of the artificial mitochondrion

Abstract

Synthetic life, as envisioned by a bottom-up synthetic biology, appears to be, much like it´s natural counterpart, highly energy demanding. Therefore, in this work, a versatile energy regeneration module was constructed via bottom-up hand-tailored reconstitution procedure to enable continuous supply of adenosine triphosphate (ATP) and another important co-factor, NAD+. This energy regeneration module can be considered as the artificial respiratory chain (ARC), consisting of four functional parts: the ATP synthase, a proton pump, a NADH dehydrogenase and a compartment. Due to the lack of the repair and replacement mechanisms in the current iteration of the artificial cell, to increase the stability and durability of the energy module, substitution of lipid compartments with the polymer or lipid/polymer hybrid ones was explored. The reconstitution procedure was devised, which enabled simultaneous insertion of several enzymes comprising the ARC in the mentioned polymer-based compartments. The enzyme insertion could be controlled by the choice of mediating detergent and the degree of membrane solubilization by the detergent. In this context, the orientation and reconstitution efficiency of the individual respiratory enzymes were determined in different types of compartments, and the final output of the energy module was analysed in the light of these reconstitution parameters. Moreover, the interplay between the respiratory enzymes and the man-made membranes was analysed in greater detail. In hybrid compartments, the analysis revealed the structural rearrangements and changes in membrane permeability following the enzyme insertion. Meanwhile the protective function of the graft copolymer against reactive oxygen species (ROS) was discovered in enzyme-functionalized polymer compartments in which the preserved enzymatic activity as well as structural integrity of the compartments was observed following the ROS treatment. To increase the efficiency of the ARC, two variants of the respiratory chain were constructed and tested for the activity – one featuring a proton-translocating respiratory complex I and another featuring non-translocating DT-diaphorase. The most active energy module was then coupled with the metabolic module comprising 17 different enzymes to form the minimal artificial organelle – minimal artificial mitochondrion – which was operational for more than an hour. To enable coupling between the two modules, the composition and osmolarity of the ARC were tuned. In order to examine the effects of fluctuating osmolarity on the activity of the ARC, osmotic stress was applied to the energy module and a staggering resistance of the module to hypertonic as well as hypotonic environment was discovered. Furthermore, membrane tightness was imperative for the establishment of proton gradient, used to drive ATP synthesis by the energy module. Therefore, Poloxamer 188 was used to mend the imperfection in lipid bilayers originating from enzyme insertion, and membrane resealing was achieved resulting in significantly increased ATP synthesis. Finally, an auxiliary oxygen supply system was developed to address oxygen depletion by the module. In this role, the oxygen release from the calcium peroxide particles was analysed and the effect of particles on the activity of the ARC was evaluated. With the oxygen supply system, a remarkable reoxygenation of the energy module was accomplished and the initial ATP synthesis at the highest rate by the module was significantly extended. Based on these findings, the respiratory tissue was proposed, which combines the essentials for continuous, versatile and efficient energy regeneration. To enable the step-wise assembly of multiprotein artificial respiratory chains with the preserved optimal configuration of each individual enzyme, membrane fusion mediated by fusogenic proteins was explored. The latter were incorporated into polymer and hybrid compartments to form a versatile and widely biocompatible minimal fusion platform. The insertion of fusogenic proteins in polymer and hybrid compartments was analysed in greater detail with respect to the protein orientation and insertion efficiency, as well as membrane architecture. In addition, protein-mediated fusion of polymer and hybrid compartments was inspected via membrane mixing, as well as the functional coupling between two respiratory enzymes. For the first time it was found that synthetic amphiphile membranes also undergo fusion, mediated by the protein machinery for synaptic secretion, and the remarkably high membrane and content mixing was observed. To elucidate the reasons for successful and efficient fusion, the pore opening dynamics were investigated, which revealed the increased stability of the pores in polymer membranes. Finally, key fusion intermediates of protein-mediated polymer and hybrid fusion were observed with cryo electron microscopy and described, offering unprecedented insights of the fusion process in this novel system.

Das künstliche Leben, so wie es von der Synthetischen Biologie mit einem bottom-up Ansatz vergegenwärtigt wird, scheint, wie sein natürliches Pendant energetisch sehr anspruchsvoll zu sein. Zur Gewährleistung einer kontinuierlichen Zufuhr von Adenosintriphosphat (ATP) und Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) wurde in dieser Arbeit ein vielfältiges Energieregenerationsmodul durch maßgeschneiderte Rekonstitution entwickelt. Dieses Modul besteht im Wesentlichen aus einer künstlichen Atmungskette (ARC - artificial respiratory chain), die sich aus vier funktionalen Einheiten zusammensetzt: der ATP-Synthase, einer Protonenpumpe, der NADH-Dehydrogenase und einem Kompartiment. Zur Erhöhung der Stabilität und Beständigkeit des Energiemoduls wurden, auf Grund der mangelnden Reparatur- und Austauschmöglichkeiten derzeitiger künstlicher Zellen, der Austausch von Lipid-Kompartimenten durch Polymer- oder Lipid/Polymer-Kompartimenten, sogenannten Hybriden, untersucht. Für die Entstehung der ARC wurde eine Rekonstitutionsmethode entwickelt, welche den simultanen Einbau mehrerer Enzyme in die erwähnten Polymer-basierten Kompartimente ermöglicht. Die Insertion der Enzyme kann zum einen durch die Wahl des Rekonstitutions-vermittelnden Detergens und zum anderen durch den Grad der Membransolubilisierung durch das Detergens bestimmt kontrolliert werden. In diesem Kontext wurden die Orientierung und die Effizienz der Rekonstitution der einzelnen respiratorischen Enzyme in den verschiedenen Kompartimenten bestimmt und die endgültige Leistung des Energiemoduls mit diesen Rekonstitutionsparametern in Beziehung gesetzt. Zudem wurden die Wechselwirkungen zwischen den Enzymen und den künstlich geschaffenen Membranen ausführlich analysiert. Untersuchungen der Hybrid-Kompartimente ergaben, dass es durch den Einbau von Enzymen zu strukturellen Umlagerungen und Veränderungen in der Permeabilität der Membran kommt, während in einem mit Enzymen funktionalisiertem Polymer-Kompartiment eine schützende Funktion des Graft-Co-polymers gegen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) festgestellt werden konnte, nachdem diese mit ROS behandelt wurden. Die Enzymaktivität und die strukturelle Integrität der Kompartimente blieb erhalten. Zur Erhöhung der ARC-Effizienz wurden zwei Varianten der Atmungskette entwickelt und auf deren Aktivität hin überprüft. Eine Variante enthielt den Protonen-translozierenden Komplex I und die andere die nicht-translozierende DT-diaphorase. Das aktivste Energiemodul wurde im Anschluss mit einem aus siebzehn Enzymen bestehenden Stoffwechselmodul gekoppelt, mit dem Ziel, ein minimales künstliches Organell - ein minimales künstliches Mitochondrium - aufzubauen, wobei das entstandene Konstrukt über eine Stunde funktionsfähig war. Um beide Module zu koppeln, wurden die Zusammensetzung und die Osmolarität der ARC angepasst. Die Auswirkung von wechselnder Osmolarität auf die Aktivität wurde durch osmotischen Stress untersucht und eine erstaunliche Widerstandsfähigkeit sowohl gegen hypertonische als auch gegen hypotonische Umgebungen festgestellt. Zudem war die Dichtheit der Membran eine feste Voraussetzung für die Schaffung eines pH-Gradienten, der wiederum zur Synthese von ATP befähigt. Fehlordnungen in der Lipiddoppelschicht, welche aufgrund der Enzym-Rekonstitutionen entstanden waren, wurden mittels Poloxamer 188 behoben und die erneute Membranversiegelung führte zu einer deutlich höheren ATP-Synthese. Um die Erschöpfung von Sauerstoff durch das Energiemodul zu beseitigen, wurde mittels Calciumperoxid-Partikeln ein zusätzliches Versorgungssystem mit Sauerstoff entwickelt und dessen Effekt auf die Aktivität der ARC untersucht. Die Freisetzung von Sauerstoff von diesen Partikeln führte zu einer erheblichen Sauerstoffanreicherung und verlängerte die höchste Anfangsrate der ATP-Synthese wesentlich. Bezüglich dieser Erkenntnisse ist die Entwicklung respiratorischer Gewebe vorstellbar, welche alle wesentlichen Voraussetzungen für eine kontinuierliche, vielseitige und effiziente Energieregenerierung besitzen. Zur schrittweisen Assemblierung multienzymatischer ARC, deren individuelle Enzyme bereits optimal konfiguriert worden sind, wurden Membranfusion-vermittelnde Proteine untersucht. Diese wurden in Polymer- und Hybridkompartimente eingebracht, um eine vielfältige und weitgehend biokompatible minimale Fusionsplattform zu errichten. Die Rekonstitution der Fusionsproteine wurde in Bezug auf die Orientierung des Proteins, die Effizienz der Insertion, wie auch auf die Membranarchitektur hin untersucht. Mit Hilfe der Membranvermischung wurde zusätzlich die Protein-vermittelte Fusion von Polymer- und Hybridkompartimenten sowie die funktionale Kopplung zwischen Enzymen der Atmungskette analysiert. Erstmals wurde festgestellt, dass auch synthetische amphiphile Membranen durch synaptische Sekretionsproteine fusionieren und zudem bemerkenswert hohe Membran- und Gehaltsvermischungen beobachtet werden konnten. Zur Ursachenfindung wurde die Porenöffnungsdynamik gemessen, die eine erhöhte Stabilität der Poren in Polymermembranen aufzeigte. Letztendlich wurden durch Kryoelektronenmikroskopie entscheidende Fusionszwischenstufen von Protein-vermittelter Polymer- und Hybridfusion beobachtet und beschrieben, die einen beispiellosen Einblick in die Fusionsprozesse in diesem neuartigen System gewährten.