Advances in enantioselective resolution applying preferential crystallization and enzymantic racemization

Abstract

Enantiomers are pairs of identical chiral molecules that have different spatial arrangement. They present similar physical and chemical properties, but can interact differently in living organisms. When used as chiral drug substances, enantiomers often promote distinct therapeutic and toxicological effects. For that reason, regulatory agencies demand for the provision of enantiopure substances. Enantiomers are often chemically synthesized as 50:50 mixtures which must be separated subsequently. Preferential Crystallization (PC) is a powerful, cost-effective technique to purify enantiomers that crystallize as conglomerates. PC is modeled using laborious population balance equations and there is a lack of simple tools allowing analysis of productivity in early process design. The method also suffers from maximum yield limitation of 50%. A racemization step can be integrated to convert the unwanted enantiomer into the target, increasing the theoretical yield to 100%. Certain enzymes are attractive racemization catalysts that are active under mild conditions required for PC. In this thesis, the use of enzymatic racemization was investigated to overcome yield limitations of preferential crystallization. To support quantitative design a simplified mathematical model capable of describing the essential features of batch preferential crystallization was proposed. The process was studied for the resolution of the chiral amino acid asparagine. The present work investigates the use of an immobilized amino acid racemase (EC 5.1.1.10) to assist chiral resolution by PC. The kinetic behavior of the enzyme was studied in both soluble and immobilized form. A column reactor packed with the immobilized racemase was evaluated under coupling conditions. The enantiomeric excess was identified as an important constraint for the coupling: PC generates small differences in the concentrations of the two enantiomers, limiting the driving force for the reaction. This challenge can be counterbalanced by increasing the dosage of the stable biocatalyst and by guaranteeing its reusability via enzyme immobilization. A new shortcut model (SCM) was developed to estimate performance indicators of PC. The reduced mathematical framework is composed of only three differential equations requiring three experiments for parametrization. The relatively simple SCM provides significant information during early stages of process development without the need for applying more detailed population balance equations. The model prioritizes relative simplicity for overall estimation of process productivity at the expense of no precise information of particle size distribution and of accepting deviations beyond strict purity specifications. A detailed experimental study to validate the model is demonstrated. The crystallization parameters and kinetics of the amino acid racemase determined experimentally were used in the SCM to evaluate improvements in performance of PC coupled with enzymatic racemization for the production of pure L-asparagine monohydrate. The results and tools reported in this work are seen as valuable contributions for more rapid performance assessment of preferential crystallization and for further development of combinations of PC with enzymatic racemization. Other purification processes may profit from the immobilized amino acid racemase characterized and successfully applied. The SCM is flexible to be adapted to other PC configurations and it is seen as advantageous for comparing PC with competing resolution techniques. This work contributes to a better understanding of coupling PC and racemization, promotes application of preferential crystallization and supports the design of more efficient and robust enantioselective crystallization processes.

Enantiomere sind Paare identischer chiraler Moleküle mit unterschiedlichen räumlichen Strukturen. Sie besitzen identische physikalische und chemische Eigenschaften, interagieren in biologischen Organismen jedoch unterschiedlich. Bei chiralen pharmazeutisch aktiven Substanzen weichen beide Enantiomere häufig erhebliche in ihrer therapeutischen und toxikologischen Wirkung voneinander ab. Aus diesem Grund fordern Regulierungsbehörden die Bereitstellung enantiomerenreiner Substanzen. Somit müssen als 50:50 Mischung erzeugte Enantiomere im Anschluss getrennt werden. Bevorzugte Kristallisation ist eine leistungsstarke und kostengünstige Technik zur Auftrennung einer bestimmten Klasse chiraler Moleküle namens Konglomerate. Für Simulationsstudien dieses Trennverfahren stehen komplexe detaillierte Prozessmodelle zur Verfügung. Einfache mathematische Modelle für Analyse von Produktivität im frühen Prozessdesign sind jedoch rar. Ein weiterer Nachteil bei der Trennung von racemischen Mischungen ist die auf 50% beschränkte Ausbeute. Durch die Kombination der Kristallisation mit Racemisierung steigt die theoretische Ausbeute auf 100%. Die Racemisierung kann von unter milden Bedingungen aktiven Enzymen katalysiert werden. In dieser Arbeit werden die Verwendung von enzymatischer Racemisierung zur Erhöhung der Kristallisationsausbeute ausgearbeitet und ein vereinfachtes mathematisches Modell vorgestellt, welches die bevorzugte Kristallisation im Batch-Prozess quantitativ beschreibt. Als Modellsystem dient dienen die Enantiomere der chiralen Aminosäure Asparagin in Kombination mit einer Aminosäure-Racemase (EC 5.1.1.10). Das kinetische Verhalten der Racemase wurde sowohl im ungebundenen als auch im immobilisierten Zustand untersucht. Die immobilisierte Racemase wurde als Festbettreaktor unter geeigneten Kopplungsbedingungen eingesetzt und bewertet. Das Maß des Enantiomerenüberschusses wurde als entscheidender Faktor bei der Kopplung identifiziert, da die bevorzugte Kristallisierung nur kleine Konzentrationsunterschiede zwischen den Enantiomeren erzeugt, was die Triebkraft für die Reaktion einschränkt. Bei der Dosierung der stabilen und wiederverwendbaren immobilisierten Racemase könnte diese Anforderungen der Teilprozesse angepasst werden. Eine neuentwickelte vereinfachte Berechnungsmethode (Short Cut Model, SCM) zur Abschätzung von Leistungsindikatoren der bevorzugten Kristallisation wurde entwickelt und validiert. Kern des Modells sind lediglich drei gewöhnliche Differentialgleichungen, für deren Parametrisierung drei Experimente erforderlich sind. Das SCM liefert in frühen Stadien der Prozessentwicklung wichtige Informationen ohne die Notwendigkeit aufwendigere Populationsbilanzen lösen zu müssen. Das Modell verzichtet dabei auf eine präzise Kristallgrößenbetrachtung und akzeptiert Abweichungen von strengen Reinheitskriterien zu Gunsten einer schnell zugänglichen Produktivitätsprognose. Eine experimentelle Studie zur Validierung des Modells wird für die Enantiomeren von Asparagin demonstriert. Die experimentell bestimmten Parameter zur Beschreibung der Kristallisation und der Kinetik der Aminosäure-Racemase wurden im verwendet, um Abschätzungen zur Leistungssteigerung des gekoppelten Modellprozesses für die Produktion von optisch reinem L-Asparagin-Monohydrat vorzunehmen. Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zur schnelleren Leistungsbewertung der bevorzugter Kristallisation und für die weitere Entwicklung der Racemattrennung in Verbindung mit enzymatischer Racemisierung. Andere entantioselektive Trennverfahren können von der hier vorgestellten immobilisierten Aminosäure-Racemase profitieren. Das SCM kann an weitere Betriebsweisen angepasst werden und bildet eine wertvolle Grundlage für den quantitativen Vergleich mit anderen Trennprozessen. Diese Arbeit trägt zum besseren Verständnis der Kopplung von bevorzugter Kristallisation und Racemisierung bei, fordert zum breiteren Einsatz der bevorzugten Kristallisation auf und trägt somit zum Design effizienterer und robusterer Kristallisationsprozesse zur Enantiomerentrennung bei.