Bottom-up assembly of a light-driven ATP regeneration module in lipid, polymer and hybrid vesicles

Abstract

The ability to design artificial protocells from modular building blocks, holds among others great promise for biotechnological application as well as for solving the origin of life puzzle. One of the major components of a minimal biological system is energy regeneration to carry out activities, such as growth, movement or reproduction. This thesis comprises the construction of a light-driven ATP regeneration module from molecular building blocks. Therefore, two proteins, Bacteriorhodopsin and ATP synthase are integrated in suitable compartments. Both enzymes are first investigated separately and are afterwards combined to form a light-driven ATP regeneration module. Optimization of different factors that influence synthesis rates, enabled the generation of ATP production rates up to 4.5 μM ATP (mg ATP synthase)-1(min-1). Keeping the bioactivity of energy converting proteins high for longer is of high relevance in biotechnology applications as well as when planning to create a minimal cell from bottom-up. Therefore, a detailed study of membrane protein functionality over time in different hybrid compartments made of graft polymer PDMS-g-PEO and diblock copolymer PBd-PEO is presented. Activity of more than 90% in lipid/polymer hybrid vesicles compared to conventional liposomes proves an excellent biocompatibility. A significant enhancement of long-term stability (80% remaining activity after 42 days) is demonstrated in polymer/polymer-based hybrids. The combination with other functional modules confirmed the capability of the ATP module to serve as energy supply to efficiently power metabolic pathways or movement in artificial protocells.

Künstliche Protozellen aus modularen Bausteinen zusammen zu setzten, eröffnet viel-versprechende Möglichkeiten im Bereich der Biotechnologie und könnte darüber hinaus neue Rückschlüsse über den Ursprung des Lebens zulassen. Eine der wichtigsten Komponenten einer “Minimalzelle” ist die Energieregeneration, welche Aktivitäten wie Wachstum, Bewegung oder Reproduktion ermöglicht. Inhalt dieser Arbeit ist die Konstruktion eines lichtgetriebenen ATP Regenerationsmoduls aus kleinsten molekularen Bausteinen. Dazu werden zwei Proteine, Bacteriorhodopsin (bR) und ATP Synthase, in geeignete Kompartimente integriert. Beide Enzyme werden zunächst getrennt voneinander analysiert und anschließend durch Ko-Rekonstitution zu einem lichtgetriebenen ATP Regenerationsmodul kombiniert. Die ATP Syntheseleistung wird durch Analyse verschiedener Einflussfaktoren optimiert. Hierdurch können Produktionsraten von bis zu 4.5 μM ATP (mg ATP synthase)-1(min-1) erreicht werden. Für biotechnologische Anwendungen, sowie für die Absicht eine künstliche Zelle aus Einzel-bausteinen zusammenzusetzen, ist es besonders wichtig die Aktivität der energieumsetzenden Proteine über einen längeren Zeitraum zu erhalten. Daher wird eine detaillierte Langzeitstudie über die Funktionalität der Membranproteinen in unterschiedlichen Hybrid-Kompartimenten durchgeführt. Diese beinhalten eine Mischung aus konventionellem Lipid und zwei Polymeren: PDMS-g-PEO und PBd-PEO. Durch Aktivitäten von mehr als 90% in Polymer/Lipid Vesikeln im Vergleich zu konventionellen Liposomen, kann zunächst eine hervorragende Biokompatibilität beider Polymere nachgewiesen werden. Sowohl die Lipid/Polymer-Hybride, als auch reine Polymer/Polymer-Hybride erhöhen die Langzeitstabilität der Membranproteine signifikant. Die maximal verbleibende Aktivität von etwa 80% nach 42 Tagen, kann jedoch in Polymer/Polymer-Hybriden, die aus jeweils 50% PDMS-g-PEO und 50% PBd-PEO bestehen, gezeigt werden. Dass sich das ATP Modul tatsächlich zur Energieversorgung einer minimalen künstlichen Zelle eignet, kann durch erfolgreiche Kombination mit einer metabolischen Reaktion sowie durch Kopplung mit Elementen des motorischen Apparats der Zelle, bestätigt werden.