In vitro and in vivo caspase-3 knock down by poly (butyl cyanoacrylate) nanaoparticle-based RNA interference

Abstract

Apoptose ist einer der wesentlichen Mechanismen, der zum neuronalen Tod nach einer Schädigung des zentralen Nervensystems (ZNS) führt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Nanopartikel-basiertes Transportsystem zu entwickeln, welches eine Behandlung der Netzhaut (Retina) mit „Caspase-3 small interference RNA“ (Caspase-3 siRNA) ermöglicht. Dies soll die Retina, die eine Struktur des ZNS ist, vor der schädigenden apoptotischen Pathophysiologie nach traumatischen Verletzungen schützen. Die Netzhaut ist für Mensch und Tier bei der Interaktion mit der Umwelt von großer Bedeutung. Die meisten Patienten mit zerebralen und ophthalmologischen Erkrankungen sind durch den Verlust der Sehkraft, verursacht durch Trauma, grünem Star oder Optikusneuropathien etc., stark beeinträchtigt. Denn entscheidende Probleme der retinalen Nervenzellen sind folgende: eine hohe Vulnerabilität, keine Regenerationskapazität, ihr post-mitotischer Zustand sowie die durch neuronale Schäden induzierte Apoptose. Aufgrund dessen ist das Abschalten des Apoptose-Prozesses ein geeigneter Weg, um die Nervenzellen der Retina zu schützen. Ansonsten ist es schwierig, den Sehverlust zu behandeln, wenn die Zellen bereits abgestorben sind. Das Caspase-3 hat aufgrund seiner einzigartigen Funktion im Prozess der Apoptose große Aufmerksamkeit auf sich gezogen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Polymerisations- prozess auf Grundlage einer Wasser-in-Öl-Miniemulsion entwickelt, um Poly(butylcyanoacrylat)-Nanopartikel (PBCA-NP) in Form von Nanokapseln herzustellen, welche die siRNA vor dem Abbau schützen und sie in die Zielorgane und Zellen transportieren, wo sie letztendlich die Expression der Caspase-3 herunterregulieren („knock-down“). Es wurden PBCA-NP mit inkorporierter siRNA mit folgenden granulometrischen Eigenschaften hergestellt. Die Partikel hatten einem mittleren Durchmesser (d50,3) von 259,8 nm und einem Polydispersitäts-Index (PDI) von 0,233. Die PBCA-NP ohne inkorporierter siRNA wiesen einen Durchmesser von 195nm und einen PDI von 0,227 auf. Verschiedene Prozessfaktoren, einschließlich Wasser/Öl-Verhältnis, Tensid/Öl-Verhältnis, Monomer/Öl-Verhältnis sowie Tensidtyp wurden untersucht, um die PBCA-NP zu optimieren. Der Knock-down-Effekt wurde in vitro durch die Western-Blot-Methode untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Herabregulierung der Caspase-3-Expression nach Behandlung mit Caspase-3 siRNA-PBCA-NP. Als Kontrolle wurden sowohl Caspase-3 siRNA-Kalzium-Partikel als auch eine Mischung aus unbeladenen NP und Caspase-3 siRNA getestet, welche im Gegensatz zur Behandlung mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ebenfalls einen signifikanten Rückgang zeigten. Die Expression der Caspase-3 war jedoch in Vergleich zu den Caspase-3 siRNA-PBCA-NPs immer noch höher. In der vorliegenden Arbeit wurde auch für die in vivo-Prüfung der siRNA-PBCA-NP das Modell der Sehnerv-Quetschung (optic nerve crush/ONC) in Ratten verwendet. Geschädigte und naive (ungeschädigte) Augen der Ratten wurden durch intravitreale Injektion mit Caspase-3 siRNA-PBCA-NP, negativer siRNA-PBCA-NP, unbeladenen PBCA-NPs bzw. Caspase-3 siRNA-Kalzium-Partikel behandelt, und das Caspase-3 durch Immunfluoreszenzfärbung in der Retina detektiert. Hierbei zeigte sich eine Reduktion der Caspase-3-Expression nur in der post-ONC-Retina, welche mit Caspase-3 siRNA-PBCA-NP soweit verringert werden konnte, dass vergleichbare Konzentrationen wie in der naiven Netzhaut erzielt werden konnten. Die Kontroll-Behandlungen mit negativen siRNA-PBCA-NP, unbeladenen PBCA-NP und Caspase-3 siRNA-Kalzium-Partikeln hingegen reduzierte die hohe Konzentration des Caspase-3 post-ONC nicht. Neben der lokalen Anwendung von PBCA-NP wurde die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke in vivo mittels konfokalem Neuroimaging (ICON) untersucht. Mit Rhodamin 123 markierte PBCA-NP wurden im Gewebe der Netzhaut innerhalb von einer Minute nach intravenöser Injektion über die Schwanzvene sichtbar. In den nachfolgenden zwei Stunden blieb das Signal in der Netzhaut bestehen, was mittels ICON beobachtet werden konnte. Das Ergebnis weist darauf hin, dass PBCA-NP als Trägersubstanz die Blut-Hirn-Schranke überwinden können und somit Medikamente in das Netzhautgewebe freisetzen könnten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass siRNA-PBCA-NP ein neuer therapeutischer Weg sein könnte, den Tod von retinalen Ganglienzellen zu verhindern. Dies bedarf aber weiterführender präklinischer und klinischer Studien.

Apoptosis is one of the main mechanisms leading to neuronal death after central nervous system (CNS) damage. The aim of the current work is to design a nanoparticle-based delivery system to bring caspase-3 small interfering RNA (siRNA) to the retina, which comprises of CNS tissue, to prevent the deleterious apoptotic pathophysiology after traumatic injury. The retina is of great importance to humans and animals, for interacting with the environment. Most patients who have vision loss caused by trauma, glaucoma, optic neuropathy, etc. suffer from the gradual deterioration of their vision because of optic nerve and retinal ganglion cell programmed cell death, called apoptosis. This is particularly problematic because of the following crucial disadvantages of the affected cells: high vulnerability, non-regeneration, post-mitotic, an irreversible apoptosis induced neuronal damage. Therefore, an important goal is to prevent or stop the apoptosis process so to protect the nerve cells in the retina from dying. Otherwise it would be difficult to recover their vision once the nerve cells are dead. Caspase-3 has drawn wide attention because of its unique role in the apoptosis process. Therefore, it would be desirable to find means to antagonize apoptosis. In this study, I designed a water-in-oil mini-emulsion polymerization system to produce poly (butyl cyanoacrylate) nanoparticles (PBCA NPs) as nanocapsules, with the goal to protect siRNA from biodegradation, deliver it into target organs and cells, and finally, to down-regulate caspase-3 expression (“knock-down”). To this end, siRNA encapsulated in PBCA NPs was produced with a median diameter (d50,3) of 259.8 nm and a Polydispersity Index (PDI) of 0.233. Specification of blank PBCA NPs was 195 nm in d50,3 and 0.227 in PDI. Different factors, including water/oil rate, surfactants/oil rate, butylcyanoacrylate monomer/oil rate, and surfactant types, were investigated to optimize the PBCA NPs. The knock-down effect was documented by using western blot analysis in vitro. A down-regulation of caspase-3 gene appeared after the treatment with caspase-3 siRNA-PBCA NPs. For control purposes, caspase-3 siRNA-calcium particles and the casp3 & NPs were tested as well. In the C6 cells, they lead a significant decrease in caspase-3 expression compared to the treatment with phosphate buffered saline (PBS), but still have higher caspase-3 expression compared to the treatment with caspase-3 siRNA-PBCA NPs. To test the effects in vivo, a rat optic nerve crush (ONC) model was employed in this study. Lesioned and naive eyes of the rats were treated with caspase-3 siRNA-PBCA NPs, negative siRNA-PBCA NPs, blank PBCA NPs or caspase-3 siRNA which were delivered into the eye by intravitreal injection. The immunofluorescence technique was used to detect caspase-3 in the retina. A reduction of caspase-3 expression was found in the post ONC retina only when rats were treated with caspase-3 siRNA-PBCA NPs. Here, the concentration of caspase-3 in the retina decreased to the near-normal concentration of the naive retina. The control treatments using negative siRNA-PBCA NPs, blank PBCA NPs and caspase-3 siRNA-calcium particles did not result in the decrease of the elevated caspase-3 concentrations post ONC. In addition to the local application of the PBCA NPs, the passage across the blood brain barriers was investigated using an in vivo confocal neuroimaging (ICON) system in living rats. Rhodamine 123 labelled PBCA NPs were detected in the retinal tissue within 1 min after intravenous injection into the tail vein. This signal persisted for 2 hrs in the retina as monitored by ICON. It confirmed the value of PBCA NPs as a carrier to pass the blood brain barrier and its potential to release drugs into retina tissues. In summary, the results of the present thesis suggest that siRNA-PBCA NPs can serve as a potential therapeutic tool to reduce retinal ganglion cell death, but this requires further pre-clinical and clinical studies.