Analysis of the mammalian pre-mRNA 3' end processing cleavage complex and attempts of its reconstitution

Abstract

Das Ziel dieser Dissertation war die Reinigung des kompletten und funktionalen Komplexes der Prä-mRNA 3' Endprozessierung. Zuerst sollte der Komplex assembliert an immobilisierter Prä-mRNA gereinigt werden. Dazu wurden zwei verschiedene RNAAffinitätsmethoden verwendet; die Tobramycin-Affinitäts-Selektions-Methode und eine RNA-Affinitätschromatographie beruhend auf der Interaktion des Antiterminatorproteins N und des BoxB-RNA-Elementes des Phagen λ. Verschiedene Experimente wurden durchgeführt um die Methoden für die Reinigung des Spaltungskomplexes anzupassen. Jedoch war die Reinigung nicht erfolgreich. Daher wurde im zweiten Teil der Dissertation ein anderer Weg beschritten. Alle bis dahin bekannten Untereinheiten des Spaltungskomplexes wurden als Fusion mit einem His-Flag-Affinität-tag stabil in HEK293 Zellen integriert und affinitätsgereinigt. Anschliessend erfolgte die Analyse mittels Massenspektrometrie, Western blot und Aktivitätsexperimenten. Die Reinigung von CF Im über verschiedene Untereinheiten (UE) ergab, dass dieser Komplex aus mindestes zwei kleinen und zwei großen UE bestehen könnte. Massenspektrometrie der CstF HF-64K Präparation ergab die Co-Elution von einigen CPSF UEs. Das demonstriert die starke Interaktion beider Sub-Komplexe. CF IIm wurde über die hClp1 UE affinitätsgereinigt. Diese Präparation enthielt neben hClp1 und hPcf11 auch Faktoren des tRNASpleißkomplexes. hClp1 ist wahrscheinlich Bestandteil zweier verschiedener Proteinkomplexe, dem CF IIm und der tRNA-Spleißkomplex. CPSF wurde über das Fusionsprotein CPSF-73K gereinigt und enthielt alle bekannten CPSF-UE und die assoziierten Faktoren hFip1 und Symplekin. Diese affinitätsgereinigten Proteine wurden mit rekombinant gereinigter PAP für die Rekonstitutionsexperimente des Spaltungskomplexes verwendet. Trotz verschiedene experimentelle Bedingungen konnte keine Spaltungsaktivität rekonstituiert werden.

The aim of this PhD work was the purification of a complete and functional pre-mRNA 3' end processing cleavage complex. The complex should be assembled on an immobilised RNA and purified via RNA affinity methods; the tobramycin affinity selection method and another RNA affinity chromatography approach, based on the interaction of the BoxB RNA element from Phage λ and the antiterminator protein N. Several attempts were made to adapt these methods for the cleavage complex. Nevertheless, it was not possible to purify a pre-mRNA cleavage complex. Thus we changed the tools for the affinity purification of the cleavage factors from human cells, for the reconstitution of the cleavage reaction. All known sub-complexes of the 3' end processing cleavage complex were affinity purified via his8-flag-tag, analysed by mass spectrometry, western blot and activity assays. Purification via different subunits revealed that CF Im probably is a multimeric protein complex, consisting at least two of each of the two subunits. Mass spectrometry analysis of the CstF HF-64K preparation revealed the copurification of some CPSF subunits. This demonstrates the tight interaction of CPSF and CstF. CF IIm was purified via HF-hClp1 and contained three proteins of the tRNA splicing endonuclease complex in addition to hClp1 and hPcf11. hClp1 is probably present in two complexes, the tRNA splicing endonuclease complex and CF IIm. CPSF was purified via tagged CPSF-73K and contained all known subunits, and the associated factors hFip1 and symplekin. These affinity purified proteins were used together with recombinant poly(A) polymerase in an attempt to reconstitute the cleavage complex. Although a set of different experimental conditions were tested, cleavage activity was not observed.