Hydroxyzimtsäureamide in Zellkulturen von Kartoffel - Isolierung und Charakterisierung eines THT cDNA-Klons aus Solanum tuberosum

Abstract

Eine der am häufigsten vorkommenden Krankheiten der Kartoffelpflanze (Solanum tuberosum L.) ist die Blatt- und Knollenfäule, die durch Befall mit dem Pilz Phytophthora infestans ausgelöst wird. Pflanzen haben zum Schutz vor Pathogenen effiziente Abwehrmechanismen entwickelt. Die pflanzliche Zellwand stellt dabei die erste wirkungsvolle Barriere gegenüber einem potentiellem Pathogen dar. Eingelagerte phenolische Verbindungen könnten nach Pathogenbefall zu einem fungistatischen Zellwandkomplex und weiterführend zu einer erhöhten Resistenz der Pflanze führen. Unter anderem könnten dabei in Hydroxyzimtsäureamide, wie z.B. 4-Cumaryl- und Feruloyltyramin sowie 4-Cumaroyl- und Feruloyloctopamin, deren Bildung durch das Enzym der Hydroxzimtsäure-CoA: Tyramin N-Hydroxyzimtsäuretransferase (THT) katalysiert wird, eine Bedeutung besitzen. Die Existenz dieser Verbindungen sowie der THT konnte bisher vorallem in Kartoffel (Solanum tuberosum L.) und Tabak (Nicotiana tabacum) nachgewiesen werden (Negrel & Javelle, 1997; Schmidt et al., 1998). Eine aus elicitierten Zellkulturen von Kartoffel (Solanum tuberosum L. cv. Desirée) hergestellte cDNA Bank sowie eine genomische Bank wurden mit einem THT-spezifischem PCR-Fragment gescreent. Der THT-codierende Bereich wurde kloniert und in E.coli exprimiert. Die rekombinante THT besteht aus 248 Aminosäuren, besitzt eine berechnete Molmasse von 28,4 kDa und zeigt eine dimere Struktur. Die Sequenz ist nahezu homolog zur THT aus Tomate (Farmer et al., 1999) und zeigt teilweise Übereinstimmung zu Spermidin/Spermin N-Acetyltransferasen (Lu et al., 1996). Die biochemischen Eigenschaften stimmen weitgehend mit dem aus Kartoffel-Zellkulturen gereinigten Protein überein. Transkriptmengen wurden hauptsächlich in Wurzeln der Kartoffelpflanze lokalisiert. Die THT ist als Multigen kodiert (Schmidt et al., 1999). Eine Akkumulation von Transkripten konnte nach Verwundung, Behandlung mit P. infestans-Sporensuspension, Bakterieninokulation sowie nach Abscisinsäure-, Salicylsäure- und Methyljasmonat-Behandlung von Kartoffelblättern nachgeweisen werden. Transgene Kartoffel- und Tabakpflanzen zeigten bisher keine erhöhte THT-Aktivität. Da es bisher nicht möglich war THT-sensitive Antikörper zu gewinnen, soll zukünftig eine erneute Herstellung erfolgen. Neue transgene Pflanzen, die eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte THT-Aktivität besitzen, sollen hergestellt und auf eine erhöhte Resistenz gegenüber P. infestans hin untersucht werden. Vorhandene genomische THT-Klone sollen genutzt werden, um Promotorstudien durchzuführen. Letztendlich soll die THT kristallisiert und die Raumstruktur aufgeklärt werden.