A modular platform for growth of hybrid and polymer membrane systems by vesicle fusion

Abstract

The MaxSynBio research project aims to construct artificial cells through mimicking predefined cell functions by a bottom-up approach via the assembly of functional parts and modules. Together with energy, metabolism, division, signaling and motility, growth represents one of the essential cell functions. This thesis was focused on the development of a growth module for artificial cells by achieving membrane expansion via vesicle fusion. Four different growth strategies were explored based on electrostatic interactions between the membranes, physicochemical factors (mechanical stress or dehydration) or fusogenic (soluble NSF-attachment protein receptor, SNARE) proteins. Relevant protocols, such as giant unilamellar vesicles (GUVs) and proteoGUVs formation, were developed, and the efficiency of each growth mechanism was analyzed through size distribution, membrane and content mixing. The membrane-bound compartments were formed from the copolymer poly(dimethylsiloxane)-graft-poly(ethylene oxide) (PDMS-g-PEO) or its blends with lipids. Prior to exploring growth mechanisms, their biophysical characteristics (bending rigidity, lateral diffusion, membrane disorder, proton permeability, durability and chemical stability) were analyzed and compared to pure lipid compartments. Furthermore, a model membrane protein bo3 oxidase was reconstituted in GUVs and its interplay with polymer and hybrid membrane was studied. The investigated membranes interacted differently with the reconstituted protein: while insertion of bo3 oxidase in soy phosphatidylcholine (PC) decreased the fluidity, it exercised the opposite effect on the polymer by loosening its structure. Characteristics of hybrid membranes were shown to be not always intermediate between lipid and polymer ones – blending the membrane led to overall increased proton permeability, but after proton pump insertion the compartments were surprisingly resealed, which was attributed to beneficial hybrid membrane rearrangement. Another example of non-intermediate characteristic of hybrid membranes was the bending rigidity, whereby the prevailing component (i.e., the polymer) dictated the membrane softness. Both hybrid and polymer membranes were shown to further soften upon insertion of largely hydrophobic membrane proteins. Furthermore, PDMS-g-PEO appears to increase the functional lifetime of membrane proteins and their resistance to reactive oxygen species (ROS). The first growth mechanism investigated in the thesis was based on electrostatic attraction between the membranes. Utilizing natural anionic and synthetic cationic lipids, oppositely charged vesicles, containing predominatly PDMS-g-PEO were formed and their fusion was explored. Partially replacing lipids with synthetic polymer PDMS-g-PEO led to significantly increased fusion efficiency. Furthermore, the results revealed that charged lipids are not required in both of the fusion-intended vesicle populations; neutral hybrids could be utilized instead of anionic ones, which also led to higher content mixing. Second growth mechanism was induced by mechanical stress in presence of salt and was limited to polymersomes. The approach was shown to be compatible with essential artificial cell functions, such as encapsulation of cytosolic components and the reconstitution of membrane machinery. Furthermore, the type of salt dictated the type of newly grown polymer structures upon agitation (GUVs in KCl and long tubes and polymer beads in NaCl), while the presence of dUTP caused the formation of tightly connected PDMS-g-PEO GUVs, similar to tissues. The third growth mechanism explored here was fusion/electroformation – a two-step mechanism. In the first step, LUVs were fused by partial dehydration, and in the second step GUVs were grown via electroformation. The approach was tuned for each type of tested membranes: PDMS-g-PEO, PDMS-g-PEO/soy PC and soy PC, and protein-functionalized microcompartments were successfully grown. Moreover, this work demonstrated that the optimized approach could be utilized for different types of membrane proteins – transmembrane peptides or complex mostly hydrophobic or asymmetric proteins. The method resulted in active enzymes – tested via proton pumping for bo3 oxidase, ATP synthesis for F1FO-ATPase, and fusion for SNAREs. Finally, the approach was extended to the growth of multicompartmentalized microcompartments, which platform will enable the integration of artificial organelles into artificial cells. The last, fourth, growth approach studied in this work utilized SNARE proteins, which are key components driving membrane fusion in nature. Utilizing know-how for the formation of protein-functionalized microcompartments (obtained by optimizing the fusion/electroformation approach), 2–40 μm SNARE-functionalized GUVs were formed. Interestingly, SNAREs had an opposite effect on membrane bending rigidity than the hydrophobic membrane protein (bo3 oxidase) – SNAREs rigidified both polymer and hybrid membranes. Fusion of SNARE-functionalized microcompartments was arrested in hemifusion, meanwhile, micro- and nanocompartments proceeded into pore opening and full fusion.

Die Nachahmung vordefinierter, klar abegrenzter Zellfunktionen mit Hilfe biomolekularer Teile und funktionaler Module beschreibt den Bottom-Up Ansatz in der synthetischen Biologie. Dieser Ansatz wurde in dem Forschungsprojekt MaxSynBio der Max-Planck-Gesellschaft (2014-2020) mit dem Ziel genutzt, erste Prototypen für künstliche Zellen zu erzeugen. Energieversorgung, Metabolismus, Zellwachstum, Zellteilung, Signalübertragung und Fortbewegung repräsentieren diese essentiellen Zellfunktionen. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag in diesem Kontext auf der Entwicklung von Wachstumsmodulen für zukünftige künstliche Zellkonstrukte, welche mittels Membranerweiterung auf dem Weg der Vesikelfusion erreicht werden sollte. Dazu wurden vier verschiedene Wachstumsstrategien, basierend auf elektrostatischen Interaktionen zwischen Membranen, externen Faktoren (mechanischer Stress oder Dehydration) und Fusionsproteinen (SNARE-soluble NSF-attachement protein receptor), entwickelt. Die zur Herstellung von großen unilamellaren Vesikeln (GUVs giant unilamellar vesicles) und proteinhaltigen großen unilamellaren Vesikeln (proteoGUVs) notwendigen Vorschriften wurden in dieser Arbeit entwickelt und die Effizienz des Wachstums durch Ermittlung der Größenverteilung, der Membranvermischung und der Vermischung des Vesikelinhaltes analysiert. Die membrangebundenen Kompartimente wurden mit dem Copolymer Poly(dimethylsiloxane)-graft-poly(ethylene oxide) (PDMS-g-PEO) oder aus ihrer Verbindung mit Lipiden gebildet. Deren biophysikalische Eigenschaften (Krümmungs-Steifheit, laterale Diffusion, Membranverteilung, Protonenpermeabilität, Haltbarkeit und chemische Stabilität) mussten vor der Entwicklung der Wachstumsmechanismen bestimmt werden und mit reinen Lipid-Kompartimenten verglichen werden. Weiterhin wurde ein größtenteils hydrophobes Membranprotein, die Protonenpumpe bo3-Oxidase, in GUVs rekonstituiert und sein Verhalten in Polymer- und Hybridmembranen studiert. Die untersuchten Membranen verhielten sich nach der Rekonstitution des Proteins unterschiedlich: Während der Einbau des Proteins die Fluidität von Membranen aus Soja-basierten Phosphatidycholinen (PC) herabsetzte, hatte es den entgegengesetzten Effekt auf Polymermembranen, deren Struktur durch die Rekonstitution gelockert wurde. Im Falle von hybriden Membranstrukturen hat sich gezeigt, dass deren Eigenschaften nicht immer zwischen denen der Lipid- und der Polymermembranen liegen. Eine Vermischung dieser beiden Membranarten führt zu einer erhöhten Protonenpermeabilität und zu einer breiteren Verteilung; jedoch waren nach der Rekonstitution des Proteins die Kompartimente erstaunlicherweise nahezu verschlossen. Dies ist zurückzuführen auf die vorteilhafte Neuanordnung der Makromoleküle in der hybriden Membran. Ein weiteres Beispiel dafür ist die Krümmungs-Steifheit von hybriden Membranen, in denen die vorherrschende Komponente, das polymere Makromolekül, die Weichheit der Membran vorgibt. Für beide Membranarten, Hybride und Polymere, konnte gezeigt werden, dass sie durch die Einbau von größtenteils hydrophoben Membranproteinen weicher werden. Zudem scheint das synthetische Polymer PDMS-g-PEO die funktionale Lebensdauer von Membranproteinen zu verlängern und deren Resistenz gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu erhöhen. Die ersten in dieser Arbeit untersuchten Wachstumsmechanismen basieren auf elektrostatischen Interaktionen zwischen Membranen. Unter Verwendung natürlicher anionischer und synthetischer kationischer Lipide wurden entgegengesetzt geladene Vesikel, die hauptsächlich PDMS-g-PEO enthielten, gebildet und untersucht. Das partielle Ersetzen von Lipiden durch das synthetische Polymer PDMS-g-PEO erhöhte die Fusionseffizienz. Ferner wurde herausgefunden, dass geladene Lipide in beiden fusions-gesteuerten Vesikelpopulationen während der hybriden Membranfusion nicht notwendig sind, denn neutrale Hybride können statt anionischer verwendet werden, was ebenfalls zu einer höheren Durchmischung führte. Der zweite Wachstumsmechanismus wird durch mechanischen Stress in Vorhandensein von Salz ausgelöst und ist auf Polymersome beschränkt. Es zeigte sich, dass dieser Ansatz kompatibel mit essentiellen Funktionen der künstlichen Zellen ist, wie z. B. die Enkapsulierung zytosolischer Komponenten und die Rekonstitution von membrangebundenen Prozessen. Zudem bestimmt die Art der durch das Salz hervorgerufenen Formen von neu gewachsenen, durch aktive Durhmischung entstandenen polymeren Strukturen (lange Röhren bei GUVs in KCl und Polymerkugeln in NaCl) und die Anwesenheit des Enzyms dUTP (Deoxyuridine triphosphate) bewirkt die Formierung fest verbundener PDMS-g-PEO GUVs, die wiederum gewebeähnliche Strukturen ausbilden. Der dritte in der Arbeit erforschte Wachstumsmechanismus ist die Fusion/Elektroformation - ein zweistufiger Prozess: Im ersten Schritt wurden LUVs durch partielle Dehydration fusioniert und im zweiten Schritt zu GUVs durch Elektroformation heranwachsen gelassen. Dieser Ansatz wurde genauestens für jeden Membrantyp abgestimmt: PDMS-g-PEO, PDMS-g-PEO/PC (Soja) und PC (Soja). Als Resultat konnten erfolgreich Protein-funktionale Mikrokompartimente erzeugt werden. Dabei zeigte sich, dass der gewählte Ansatz für verschiedene Arten von Membranproteinen, transmembrane Peptide oder komplexe, größtenteils hydrophobe oder asymmetrische Proteine, verwendet werden kann. Die Methode resultierte in aktiven Enzymen, wie für die Protonenpumpe bo3-Oxidase, die Synthese von ATP mit der F1FO-ATPase und die Fusion von Vesikeln durch SNARE-Proteine nachgewiesen. Letztendlich wurde der Ansatz auch auf Multi-Mikrokompartimente erweitert. In der längerfristigen Perspektive könnte die entwickelte Plattform für die Integration künstlicher Organellen in künstliche Zellen nutzbar gemacht werden. Der letzte, vierte Ansatz, der in dieser Arbeit untersucht wurde, beschäftigte sich mit SNARE-Proteinen, welche in der Natur als der Schlüsselproteinkomplex für Membranfusionen bekannt sind. Die Anwendung des in der Optimierung des Fusions-/Elektroformation-Wachstumsansatzes erworbenen Knowhows zum Aufbau Protein-funktionalisierter Mikrokompartimente führte zur Entwicklung von 2-40 μm großen SNARE-funktionalisierten GUVs. Interessanterweise hatten die SNAREs einen entgegengesetzten Effekt auf die Membran-Krümmungs-Steifheit als die größtenteils hydrophoben Membranproteine (bo3 Oxidase). Durch die SNAREs wurden sowohl die polymeren, als auch die hybriden Membransysteme steifer. Die Fusion der SNARE-funktionalisierten Mikrokompartimente verharrte in einer Hemifusion, während es bei der Fusion zwischen Mikro- und Nanokompartimenten zur Porenöffnung und vollständigen Fusion kam.