Cell culture-based production of influenza A virus-derived defective interfering particles

Abstract

With annual epidemics and occasionally severe pandemics, influenza A virus (IAV) represents a major human pathogen. Additional to the prevention of viral infections using vaccines, antiviral drugs represent a treatment option. However, resistances against currently used antivirals have already been reported, demonstrating the need for novel treatment modalities. An approach that was previously suggested is the use of defective interfering (DI) particles (DIPs) as antiviral agents. IAV DIPs are naturally occurring virus variants, typically characterized by a large internal deletion in one of their eight genomic viral RNA (vRNA) segments. Recently, a novel type of DIP, called OP7, which contains nucleotide substitutions in segment 7 vRNA instead of deletions was discovered. Due to deletions or mutations in the viral genome, DIPs express only truncated or mutated forms of functional proteins essential for viral replication. Therefore, DIPs can only propagate in a co-infection with infectious standard viruses (STVs), compensating for their defect. In such a co-infection scenario, DIPs interfere with and suppress STV replication and almost exclusively replication deficient DIPs are released, which constitutes their antiviral potential. In the presented PhD work, cell culture-based production processes for the recently discovered OP7 and a conventional DIP with a deletion in segment 1 vRNA, called DI244, were established. In the first part of this work, a cell culture-based production process for OP7 was investigated in shake flasks. A seed virus containing infectious STVs and the desired OP7 was used. First, the interplay of STV and OP7 was assessed by testing a range of multiplicities of infection (MOIs). Here, an intermediate production MOI of 1E−2, showing a good balance between OP7 vRNA replication and an acceptable suppression of overall virus production, resulted in highest OP7 yields, determined by quantitative PCR. Further, to identify the production MOI yielding the highest biological efficacy, an in vitro interference assay was used. More specifically, STV-infected cells were co-infected with DIP material, and the reduction of released infectious virus particles was determined. Here, OP7 material produced at MOI 1E−2 showed the highest interfering efficacy and reduced the infectious virus titer by approximately four orders of magnitude. Next UV-irradiation was used, to inactivate infectious STVs in the produced OP7 material, which are unwanted for a potential application. Finally, the production process was transferred to a laboratory-scale stirred tank bioreactor (STR). Results obtained showed a very high comparability to small scale experiments in shake flasks. In the second part of this PhD work, a system for production of purely clonal DI244 without contaminating STVs was investigated. DI244 has a deletion in vRNA segment 1 encoding for the viral polymerase basic protein 2 (PB2). Therefore, a genetically modified suspension cell line expressing PB2 and a purely clonal DI244 seed virus (both provided by a collaboration partner) were used. First, the impact of the multiplicity of DIP (MODIP) on DI244 yield was investigated in batch cultivations in shake flasks. Here, the highest interfering efficacy was observed for material produced at MODIP 1E−2, which reduced the infectious virus titer by approximately one order of magnitude. Lower interfering efficacies observed for lower production MODIPs were likely caused by the increased formation of virus particles lacking the DI244 vRNA. The produced DI244 did not require UV-irradiation, as it did not contain any STVs. Next, the production process was transferred from shake flask to a laboratory-scale STR. Here, very similar virus replication dynamics were observed independent of the production scale. Finally, process intensification strategies were applied to improve the DI244 yield in the STR. Here, a perfusion process using an alternating tangential flow filtration (ATF) system for cell retention was used. DIP titers more than 10-fold higher than for batch cultivations were observed. Next, the perfusion rate was controlled using a capacitance probe measuring the viable cell volume in the cultivation vessel. The control resulted in sufficient metabolite concentrations and low waste product levels over the entire cultivation time. Furthermore, a novel tubular cell retention membrane was investigated for its potential for continuous virus harvesting into the permeate. In contrast to a commonly used hollow fiber membrane, the tubular membrane showed no significant retention of the produced virus particles and offers interesting possibilities for establishment of advanced process integration strategies. Furthermore, DIP material produced in the context of this PhD work was used by collaboration partners for animal experiments. Here, the administration of the produced OP7 or DI244 protected mice against an otherwise lethal dose of IAV STVs, clearly demonstrating its antiviral potential. Summarized, cell culture-based production processes were successfully established for both DIPs, DI244 and OP7, yielding material with a high DIP titers and high interfering efficacies. Further, the successful scale-up to a laboratory-scale STR could be shown for both production processes and process intensification strategies were applied for DI244 production. Overall, the presented work exhibits the feasibility of cell culture-based production of DIP material for antiviral therapy.

Mit jährlichen Epidemien und gelegentlich schweren Pandemien ist das Influenza-A-Virus (IAV) eines der bedeutendsten humanen Krankheitserreger. Die Behandlung mit antiviralen Medikamenten stellt eine Ergänzung zur Prävention mit Impfstoffen dar. Allerdings wurden bereits Resistenzen gegen derzeit verwendete antivirale Medikamente beobachtet, was die Notwendigkeit neuer Behandlungsmodalitäten aufzeigt. Ein Ansatz, der bereits früher diskutiert wurde, ist die Verwendung von defekten interferierenden (DI) Partikeln (DIPs) als antivirales Medikament. IAV DIPs sind natürlich entstehende Virusvarianten, die typischerweise durch eine große interne Deletion in mindestens einem ihrer acht genomischen viralen RNA (vRNA)-Segmente charakterisiert sind. Zusätzlich wurde kürzlich ein weiterer DIP entdeckt, genannt OP7, welcher sich anstelle von Deletionen nur durch Nukleotid-Substitutionen in vRNA-Segment 7 auszeichnet. Aufgrund der Deletion oder der Mutationen im viralen Genom exprimieren DIPs nur verkürzte oder mutierte Formen von funktionellen Proteinen, welche für die virale Replikation essentiell sind. Daher können DIPs in der Regel nur in einer Ko-Infektion mit infektiösen Standardviren (STV) replizieren, die ihren Defekt kompensieren. In einer solchen Ko-Infektion stören und inhibieren DIPs die STV-Replikation und es werden fast ausschließlich DIPs gebildet, was ihr antivirales Potenzial begründet. Die vorliegende Doktorarbeit befasst sich mit der Etablierung von zellkulturbasierten Produktionsprozessen zur Herstellung des kürzlich entdeckten OP7 und eines konventionellen DIPs mit einer Deletion in vRNA-Segment 1, genannt DI244. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein zellkulturbasierter Produktionsprozess für OP7 im Schüttelkolben untersucht. Hierfür wurde ein Saatvirus verwendet, das eine Mischung aus infektiösem STV und OP7 enthält. Zunächst wurde die Interaktion von STV und OP7-vRNA beleuchtet, indem verschiedene Multiplizitäten der Infektion (MOI) getestet wurden. Dabei führte eine mittlere MOI von 1E−2 zu den höchsten OP7-Ausbeuten, da diese ein gutes Gleichgewicht von OP7- Replikation und einer akzeptablen Unterdrückung der gesamten Virusproduktion erlaubte. Um die Produktions-MOI zu ermitteln bei der Material mit der höchsten biologischen Wirksamkeit erzeugt wird, wurde ein in-vitro-Interferenzassay durchgeführt. Dafür wurden STV-infizierte Zellen mit DIP-Material koinfiziert und die Reduktion der freigesetzten infizierenden Viruspartikel bestimmt. Hier zeigte OP7-Material, das mit einer MOI von 1E−2 hergestellt wurde, die höchste interferierende Wirksamkeit und reduzierte den Titer des infektiösen STV um etwa vier Größenordnungen. Anschließend wurde eine UV-Bestrahlung durchgeführt, um infektiöses STV im produzierten OP7-Material zu inaktivieren, welches in einer potenziellen Anwendung unerwünscht wäre. Im Anschluss wurde der Produktionsprozess auf einen Rührkessel-Bioreaktor (STR) im Labormaßstab übertragen. Hier zeigte sich eine sehr hohe Vergleichbarkeit zu den Versuchen in Schüttelkolben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Produktionssystem zur Herstellung von reinem DI244, ohne Kontamination mit STV, untersucht. DI244 hat eine Deletion im vRNA Segment 1, dass das virale Polymerase-Basisprotein 2 (PB2) kodiert. Daher wurden eine gentechnisch veränderte Suspensionszelllinie, die PB2 exprimiert, und ein rein klonales DI244-Saatvirus verwendet (beides bereitgestellt von einem Kooperationspartner). Zunächst wurde die Auswirkung der Multiplizitäten der DIPs (MODIP) auf die DI244-Ausbeute in Batch-Kulturen in Schüttelkolben untersucht. Dabei wurde die höchste interferierende Wirksamkeit für Material produziert mit MODIP 1E−2 beobachtet, welches den infektiösen Virustiter um etwa eine Größenordnung reduzierte. Die geringeren interferierenden Wirksamkeiten, die für Material produziert bei niedrigeren MOIs beobachtet wurden, sind wahrscheinlich auf eine vermehrte Bildung von Viruspartikeln zurückzuführen, denen die DI244 vRNA fehlte. Das produzierte DI244-Material benötigte keine UV-Inaktivierung, da es keine STV enthielt. Als Nächstes wurde der Produktionsprozess vom Schüttelkolben auf einen STR im Labormaßstab hochskaliert. Unabhängig vom Produktionsmaßstab wurde eine sehr ähnliche Virusreplikationsdynamik beobachtet. Schließlich wurden Prozessintensivierungsstrategien angewendet, um die DI244 Ausbeute im STR zu erhöhen. Unter Verwendung eines alternierenden Tangentialflussfiltrationssystems (ATF) zur Zellrückhaltung wurde ein Perfusionsprozess etabliert. Hier wurden 10-mal höhere DIP-Titer als bei vorherigen Batch-Kulturen erreicht. Als nächstes wurde die Perfusionsrate unter Zuhilfenahme einer Kapazitätssonde, deren Signal zum Volumen der Zellen im Kultivierungsgefäß korreliert werden konnte, geregelt. Diese Reglung resultierte in Substrat- und Nebenproduktkonzentrationen, die ein exponentielles Zellwachstum und effiziente Virusreplikation erlaubten. Des Weiteren wurde eine neuartige tubulare Zellrückhaltemembran auf ihr Potenzial zur kontinuierlichen Virusernte untersucht. Im Gegensatz zu einer üblicherweise verwendeten Hohlfasermembran zeigte die tubulare Membran keine signifikante Rückhaltung der produzierten Viruspartikel und bietet interessante Möglichkeiten für Prozessintegrationsstrategien. Darüber hinaus wurde das im Rahmen dieser Doktorarbeit hergestellte DIP-Material von Kooperationspartnern für Tierversuche verwendet. Hier schützte die Verabreichung des produzierten OP7 oder DI244 Mäuse vor einer andernfalls tödlichen Dosis von IAV STV, was eindeutig ihr antivirales Potenzial belegt. Zusammengefasst konnten für beide DIPs, OP7 und DI244, zellkulturbasierte Prozesse etabliert werden, die die Produktion von Material mit hohen DIP-Titern und hohen antiviralen Wirksamkeiten ermöglichen. Für beide Produktionssysteme konnte erfolgreich die Skalierbarkeit auf einen STR im Labormaßstab gezeigt werden. Für die DI244-Produktion wurden Prozessintensivierungsstrategien angewandt und ermöglichten sehr hohe DI244-Titer. Die vorliegende Arbeit zeigt deutlich das Potenzial der zellkulturbasierten Produktion von DIPs für eine antivirale Therapie.