Development of single-cell analysis methodologies to investigate segregation and dynamics of defined genomic regions during meiosis and interphase - [kumulative Dissertation]

Abstract

Die Analyse einzelner Zellen mittels Genomsequenzierung (GS) oder der Mikroskopie von lebenden Zellen ist ein sich schnell entwickelndes Forschungsgebiet. Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Etablierung von zwei unterschiedlichen Methoden der Einzelzellanalyse in Pflanzen. Um direkt meiotische Rekombination auf DNA-Sequenzebene zu messen, wurde im ersten Teil dieser Studie die GS einzelner Pollenzellkerne in der Gerste etabliert. Ziel war es, das geringe Durchsatzpotenzial und die begrenzte Auflösung von Mikroskopiemethoden zu adressieren. Die entwickelte Einzelpollenanalyse ermöglicht eine Auflösung von ~1 Mbp, welche der konventionellen Mikroskopie überlegen ist. Im zweiten Teil wurde das CRISPR-Cas9 System für die Visualisierung von Telomer DNA Sequenzen in lebenden N. benthamiana Zellen eingesetzt. Ziel war es, eine Nuklease-inaktive CRISPR-dCas9 Variante in Pflanzen zu etablieren und die Eignung dieser Methodik zur Visualisierung räumlich-zeitlicher Dynamiken zu demonstrieren. Es wurde gezeigt, dass Telomer DNA Sequenzen zuverlässig mittels CRISPR-dCas9 in lebenden Zellen sichtbar gemacht werden können.

Single-cell analysis via whole-genome sequencing (WGS) or live cell imaging is an exciting field in which many unknown factors of cellular processes remain to be discovered. The current study deals with advancing two different single-cell analysis methods in plants. First, single-cell WGS was established in barley to directly measuring meiotic recombination frequency at the DNA sequence level. The aim of this part was to address the low potential of sample throughput and limited resolution via microscopy-based methods. Single-cell WGS achieves high resolution (1 Mbp) that outperforms conventional microscopy. Second, the recently discovered CRISPR-Cas9 system was repurposed for live cell imaging of telomeric DNA repeats in N. benthamiana. The aim of this part was to establish nuclease-deficient CRISPR-dCas9 for live cell imaging in plants and demonstrate its feasibility to observe spatio-temporal dynamics. We were able to demonstrate robust labelling of telomeres by CRISPR-dCas9 in living interphase nuclei of N. benthamiana.