Scalable multi-enzyme platforms for the in vitro glycoengineering of therapeutic proteins & synthesis of human milk oligosaccharides

Abstract

Sugars in their free form or conjugated to biomolecules like proteins, lipids, and small molecules have significant functional roles in different biological processes. The importance of free sugars is very pronounced in human milk — through human milk oligosaccharides (HMOs) — by directly and indirectly contributing to the cognitive and physical development of infants. In their attached form, for instance, it has been shown that certain sugar (glycan) structures significantly contribute to therapeutic properties of glycoproteins such as efficacy and half-life. However, difficulties in synthesis of free glycans in large quantities, or modification of glycans on biomolecules to different structures have limited their biotechnological application as well as fundamental understanding of their biological roles. This work proposes enzymatic synthesis and modification of oligosaccharides as a suitable approach to unlock the potential of glycosylation for various field of applications. In the principal step of this work, novel multi-enzyme cascades were developed to synthesize sugar nucleotides as glycosylation substrates. For synthesis of uridine diphosphate (UDP) sugars, uridine (Uri) and the corresponding monosaccharides were used as the major precursors. In a cascade of six enzymes and seven reactions, uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) was produced to a concentration of 66.2 mM (40.2 g/L), a synthesis yield of 97.4%, and a biocatalyst load of 0.01 genzyme/gproduct. With the same cascade, uridine diphosphate N-acetylgalactosamine (UDP-GalNAc) was produced with a similar yield. In another multi-enzymatic cascade of six enzymes and seven reactions, uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) was produced to a titer of 48 mM (27.2 g/L), a synthesis yield of 96%, and a biocatalyst load of 0.02 genzyme/gproduct. For synthesis of uridine diphosphate glucose (UDP-Glc), a cascade of seven enzymes and eight reactions was developed. The cascade was able to deliver UDP-Glc to a final titer of 48.8 mM (27.6 g/L), a reaction yield of 81.3%, and a biocatalyst load of 0.04 genzyme/gproduct. For synthesis of guanosine diphosphate (GDP) sugars, three different cascades were designed and established — one for guanosine diphosphate mannose (GDP-Man) and two for guanosine diphosphate fucose (GDP-Fuc). Guanosine (Guo) — solubilized in dimethyl sulfoxide (DMSO) — was used as the guanosine-base of GDP-sugars. In a cascade of seven enzymes and eight reactions GDP-Man was produced to a titer of 6.7 mM (4 g/L). For initial synthesis of GDP-Fuc starting from fucose (Fuc), a cascade of five enzymes and seven reactions was established which resulted in a final concentration of 7 mM (4.1 g/L). To avoid usage of expensive Fuc, the GDP-Man cascade was extended to enable the synthesis of GDP-Fuc from Man. In the cascade of 10 enzymes and 11 reactions, GDP-Fuc was produced to a final concentration of 7.6 mM (4.5 g/L) and a reaction yield of 72% after 48 h with a biocatalyst load of 0.97 genzyme/gproduct. For synthesis of cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acid (CMP-Neu5Ac), cytidine (Cyt) was used as one of the main precursors. At first, a cascade of five enzymes and six reactions was designed by using N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) as the source of monosaccharide which resulted in almost full conversion. A second cascade consisted of seven enzymes and eight reactions was developed to enable the usage of GlcNAc and pyruvate (Pyr) instead of expensive Neu5Ac. By using this cascade, CMP-Neu5Ac was produced to a titer of 24.6 mM CMP-NeuAc (15.1 g/L) and synthesis yields of 77%, 34%, and 31% corresponding to Cyt, GlcNAc, and Pyr, respectively. Adenosine triphosphate (ATP) was used in catalytic amounts in all the developed cascades and was constantly regenerated by using polyphosphate (PolyPn). Upon successful establishment of multi-enzyme cascades for synthesis of sugar nucleotides, two strategies were proposed and demonstrated for synthesis of HMOs. In the first approach — the coupling approach — the sugar nucleotide synthesis cascade was coupled to a glycosyltransferase. The one-pot setting of this strategy offers the advantage of using nucleosides in catalytic amounts. To demonstrate the practicality of this strategy and as a proof-of-concept study, synthesis of two simple HMOs — e.g., 3-fucosyllactose (3-FL), and 6'-sialyllactose (6'-SL) — was demonstrated. In the second approach — the modular approach — the product of sugar nucleotide synthesis cascade was combined with an acceptor and a glycosyltransferase. This led to synthesis of 10 different HMOs — in a proof-of-concept study. Two methods were proposed for glycoengineering of therapeutic proteins. In the first method, the addition of terminal Gal by using E. coli-derived human β-1,4-galactosyltransferase was demonstrated and enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity was shown with a chromatographic assay. In the second method, the concept of an in vitro microbial-based artificial Golgi was described by using mannosylated (high mannose) glycoproteins. For demonstration of this idea, the known inhibitor of mannosidase I — i.e., kifunensine — was added to Chinese hamster ovary (CHO) cells to produce mannosylated (Man9) immunoglobulin G (IgG) proteins. Afterwards, Man9 IgG was enzymatically trimmed to Man5 structures and further extended to Man5-G0 structure by using E. coli derived human α-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-β-N-acetylglucosaminyltransferase (MGAT1). Despite successful expression of human α-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-β-N-acetylglucosaminyltransferase (MGAT2) in E. coli, the concept was not further extended experimentally, due to inactive expression of mannosidase II in E. coli. Finally, multiple process engineering strategies are presented to demonstrate the scalability of multi-enzyme synthesis of sugar nucleotides. UDP-Gal and UDP-GlcNAc were scaled to 1 L and 4 L (directly from 200 μL), respectively, by using centrifugally clarified cell lysate. In the second strategy, six enzymes were simultaneously produced in a single E. coli strain through co-expression of their corresponding genes in order to minimize the number of independent fermentations. The combination of six enzymes enabled the synthesis of UDP-GlcNAc and UDP-Gal at 150 mL and 3 L scale, respectively. This approach was also used for synthesis of CMP-Neu5Ac at 100 mL scale. Lastly, six enzymes were co-immobilized on commercially available resins for synthesis of UDP-GlcNAc. The activity of co-immobilized enzymes was demonstrated for 20 cycles. The results presented in this work have the potential to be used for production of functional oligosaccharides (e.g., HMOs) at industrial scales as well as development of glycoengineered therapeutic proteins. Overall, I hope that the presented work can serve as a contribution to the glycobiotechnology field in the development of superior nutritious and therapeutic products to better the quality of human life.

Zucker oder Saccharide spielen in ihrer freien Form oder konjugiert an Biomoleküle (Proteine, Lipide oder andere Moleküle) bei verschiedenen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle. In der humanen Muttermilch ist die Bedeutung von freien Zuckern durch „human milk oligosaccharides” (HMOs) — sehr ausgeprägt, da diese sowohl direkt als auch indirekt zur kognitiven und körperlichen Entwicklung von Säuglingen beitragen. Es hat sich auch gezeigt, dass bestimmte Zuckerstrukturen (Glykane), in ihrer gebundenen Form, wesentlich zu therapeutischen Eigenschaften von Glykoproteinen wie Wirksamkeit und Halbwertszeit beitragen. Probleme bei der Schwierigkeiten oder bei der Übertragung und Modifikation von Glykanen auf Biomoleküle beschränken jedoch nicht nur ihre Anwendung in größerem Maßstab sondern erschweren auch die Durchführung grundlegender Studien bezüglich ihrer biologischen Rolle. Diese Arbeit schlägt die enzymatische Synthese und Modifizierung von Oligosacchariden als vielversprechenden Ansatz vor, um die Glykosylierung für verschiedene Anwendungsfelder zu erschließen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden neuartige Multienzymkaskaden zur Synthese von Zuckernukleotiden als Glykosylierungssubstrate entwickelt. Für die Synthese von Uridindiphosphat (UDP)-Zuckern wurden Uridin (Uri) und die entsprechenden Monosaccharide als Hauptvorläufer verwendet. In einer Kaskade von sechs Enzymen und sieben Reaktionen wurde Uridindiphosphat-N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc) mit einem Titer von 66,2 mM (40,2 g/L), einer Syntheseausbeute von 97,4% und einer Biokatalysatorlast von 0,01 genzym/gprodukt hergestellt. Mit der gleichen Enzymkaskade wurde Uridindiphosphat-N-Acetylgalactosamin (UDP-GalNAc) mit einer ähnlichen Ausbeute hergestellt. In einer anderen multi-enzymatischen Kaskade mit sechs Enzymen und sieben Reaktionen wurde Uridindiphosphat-Galaktose (UDP-Gal) mit einer Konzentration von 48 mM (27,2 g/L), einer Syntheseausbeute von 96% und einer Biokatalysatorlast von 0,02 genzym/gprodukt hergestellt. Für die Synthese von Uridindiphosphat-Glukose (UDP-Glc) wurde eine Kaskade aus sieben Enzymen und acht Reaktionen entwickelt. Die Kaskade war in der Lage, UDP-Glc mit einer Konzentration von 48,8 mM (27,6 g/L), einer Reaktionsausbeute von 81,3% und einer Biokatalysatorlast von 0,04 Genzym/Produkt herzustellen. Für die Synthese von Guanosindiphosphat-Zuckern (GDP) wurden drei verschiedene Kaskaden entwickelt und etabliert — eine für Guanosindiphosphat-Mannose (GDP-Man) und zwei für Guanosindiphosphat-Fucose (GDP-Fuc). Guanosin (Guo) — gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) — wurde als Guanosin-Base der GDP-Zucker verwendet. In einer Kaskade von sieben Enzymen und acht Reaktionen wurde GDP-Man bis zu einem Konzentration von 6,7 mM (4 g/L) hergestellt. Für die Erstsynthese von GDP-Fuc ausgehend von Fucose (Fuc) wurde eine Kaskade von fünf Enzymen und sieben Reaktionen etabliert, die zu einer Endkonzentration von 7 mM (4,1 g/L) führte. Um die Verwendung von teurem Fuc zu vermeiden, wurde die GDP-Man-Kaskade erweitert, um die Synthese von GDP-Fuc aus Man zu ermöglichen. In der Kaskade mit 10 Enzymen und 11 Reaktionen wurde GDP-Fuc bis zu einer Konzentration von 7,6 mM (4,5 g/L) und einer Reaktionsausbeute von 72% nach 48 Stunden mit einer Biokatalysatorlast von 0,97 genzym/gprodukt hergestellt. Für die Synthese von Cytidinmonophosphat-N-Acetylneuraminsäure (CMP-Neu5Ac) wurde Cytidin (Cyt) als einer der wichtigsten Ausgangsstoffe verwendet. Zunächst wurde eine Kaskade aus fünf Enzymen und sechs Reaktionen unter Verwendung von N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) als Monosaccharidquelle entwickelt, die zu einer fast vollständigen Umsetzung führte. Eine zweite Kaskade, bestehend aus sieben Enzymen und acht Reaktionen, wurde entwickelt, um die Verwendung von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Pyruvat (Pyr) anstelle des teuren Neu5Ac zu ermöglichen. Mit dieser Kaskade wurde CMP-Neu5Ac mit einer Konzentration von 24,6 mM CMP-NeuAc (15,1 g/L) und Syntheseausbeuten von 77%, 34% und 31% entsprechend Cyt, GlcNAc bzw. Pyr hergestellt. Adenosintriphosphat (ATP) wurde in allen entwickelten Kaskaden in katalytischen Mengen verwendet und durch die Verwendung von Polyphosphat (PolyPn) ständig regeneriert. Nach erfolgreicher Etablierung der Multienzymkaskaden für die Synthese von Zuckernukleotiden wurden zwei Strategien für die Synthese von HMOs demonstriert. In einem Kopplungsansatz wurde die Zuckernukleotid-Synthesekaskade an eine Glykosyltransferase gekoppelt. Diese Strategie bietet den Vorteil, dass Nukleoside in katalytischen Mengen verwendet werden können. Um die Realisierung dieser Strategie zu demonstrieren, wurde die Synthese von zwei einfachen HMOs — z.B. 3-Fucosyllactose (3-FL) und 6'-Sialyllactose (6'-SL) — als Proof-of-Concept-Studie durchgeführt. In einem modularen Ansatz wird das Produkt der Zuckernukleotidsynthesekaskade mit einem Akzeptor und einer Glykosyltransferase kombiniert. Dies führte zur Synthese von 10 verschiedenen HMOs. Für das Glyco-Engineering von therapeutischen Proteinen wurden zwei Methoden vorgeschlagen. Bei der ersten Methode wurde die Verbindung von endständigem Gal mit einem Antikörper unter Verwendung der aus E. coli stammenden humanen β-1,4-Galaktosyltransferase demonstriert und eine Erhöhung der Aktivität der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) mittels einem chromatographischen Assay nachgewiesen. Bei der zweiten Methode wurde das Konzept eines künstlichen Golgi Kompartments auf mikrobieller Basis in vitro unter Verwendung mannosylierter (mannosereicher) Glykoproteine beschrieben. Zur Demonstration dieser Idee wurde ein bekannter Inhibitor der Mannosidase I (Kifunensin) zu Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) gegeben, um mannosylierte (Man9) Immunglobulin G (IgG)-Proteine zu produzieren. Anschließend wurde das Man9-IgG enzymatisch auf Man5-Strukturen getrimmt und mit Hilfe der aus E. coli stammenden humanen α-1,3-Mannosyl-Glykoprotein 2-β-N-Acetylglucosaminyltransferase (MGAT1) weiter zur Man5-G0-Struktur verlängert. Trotz erfolgreicher Expression des humanen α-1,6-Mannosyl-Glykoprotein 2-β-N-Acetylglucosaminyltransferase (MGAT2) in E. coli wurde das Konzept aufgrund der inaktiven Expression von Mannosidase II in E. coli experimentell nicht weiter ausgebaut. Schließlich wurden mehrere verfahrenstechnische Strategien vorgestellt, um die Skalierbarkeit von Multi-Enzym-Synthese von Zuckernukleotiden zu demonstrieren. UDP-Gal und UDP-GlcNAc wurden unter Verwendung von abzentrifugiertem Zelllysat auf 1 L bzw. 4 L (direkt aus 200 μL) skaliert. Um die Anzahl der unabhängigen Fermentationen zu minimieren, wurden bei der zweiten Strategie sechs Enzyme gleichzeitig in einem einzigen E. coli-Stamm durch Koexpression der entsprechenden Gene hergestellt. Die Kombination von sechs Enzymen ermöglichte die Synthese von UDP-GlcNAc und UDP-Gal im Maßstab von 150 mL bzw. 3 L. Dieser Ansatz wurde auch für die Synthese von CMP-Neu5Ac im 100-mL-Maßstab verwendet. Schließlich wurden sechs Enzyme auf handelsüblichen Chromatographieharzen für die Synthese von UDP-GlcNAc co-immobilisiert. Die Aktivität der co-immobilisierten Enzyme wurde für 20 Zyklen nachgewiesen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse haben das Potenzial, für die Produktion funktioneller Oligosaccharide (z. B. HMOs) in industriellem Maßstab sowie für das Glykoengineering von Therapeutika mit besserer klinischer Wirksamkeit genutzt zu werden. Insgesamt ist zu hoffen, dass die vorgestellte Arbeit als Beitrag zur Glykobiotechnologie bei der Entwicklung von hochwertigen Nährstoffen und therapeutischen Produkten zur Verbesserung der menschlichen Lebensqualität dienen kann.