Polyionische Fusionspeptide als Kopplungsmotiv in Immuntoxinen

Abstract

Die Herstellung artifizieller, bifunktionaler Proteine wird durch moderne Biotechnologie ermöglicht. In dieser Arbeit kamen polyionische Fusionspeptide als Kopplungsmotiv zur Herstellung der Immuntoxine B3-PE38 und [F7,P34]NPY-PE38 zum Einsatz. Die Heterodimerisierung erfolgte durch ionische Wechselwirkungen zwischen entgegengesetzt geladenen Aminosäuren innerhalb der Fusionspeptide. Die Ausbeuten korrelierten mit der Anzahl der Ladungen. Ebenfalls integrierte Cysteine, die zu einer Disulfidbrücke oxidiert werden, führten zur kovalenten Fusionierung. Die Einführung einer Thrombinspaltstelle in die polyionischen Fusionspeptide ermöglichte die Abspaltung der geladenen Aminosäuren nach kovalenter Dimerisierung. Im Vergleich zeigten die Immuntoxine gleiche biologische Aktivitäten in Zellkulturexperimenten, unabhängig ob sie mit oder ohne die geladenen Aminosäuren eingesetzt wurden. Die spezifische zytotoxische Wirkung erfolgte bereits mit niedrigen nanomolaren Konzentrationen. Das Immuntoxin [F7,P34]NPY-PE38 ermöglichte erstmals die therapeutische Zelladressierung über den Y1-Rezeptor.

Modern biotechnology allows the production of artifical bifunctional proteins. In this work, production of the immunotoxins B3-PE38 und [F7,P34]NPY-PE38 was based on polyionic fusion peptides. They cause heterodimerization of the fusion partners by ionic interaction due to oppositely charged amino acids within the fusion peptides. It was shown that interaction gets stronger with higher amount of charges. Additionally integrated cysteines will form covalent disulfide upon oxidation reaction. The insertion of a thrombin cleavage site allowed removal of the charged amino acids after covalent bonding. Both types of immunotoxins showed similar biological activities in cell culture no matter whether they were applied with or without charged amino acids in the polyionic fusion peptides. Specific cytotoxic activity was already achieved with low nanomolar concentrations on cells. The immunotoxin [F7,P34]NPY-PE38 is the first molecule that potentially facilitates therapeutic cell targeting via human Y1-receptor.