Structural and functional characterization of free thiol groups in von Willebrand factor

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Funktion des von Willebrand Faktors (VWF) in der primären Hämostase. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Funktion, Mengenbestimmung und Verteilung der freien Sulfhydrylgruppen des plasmatischen VWFs. Die Funktion der freien Sulfhydrylgruppen unter sehr hohen arteriellen Scherraten, insbesondere die Interaktionen, die die Adhäsion der Thrombozyten an Kollagen III vermitteln, sollten untersucht werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war sowohl die Bestimmung der Verteilung der freien Sulfhydrylgruppen innerhalb von VWF Multimeren als auch die Ermittlung deren genauer Position im VWF Monomer. Weiterhin wurden die Unterschiede in der Zugänglichkeit freier Sulfhydrylgruppen zwischen gelöstem und Kollagen III-gebundenem VWF untersucht. Die Blockierung der freien Sulfhydrylgruppen in plasmatischem-VWF verursachte eine signifikante Abnahme der VWF Aktivität bezüglich der Vermittlung der Thrombozytenadhäsion an Kollagen III. Die beobachtete Aktivitätsabnahme war ein kombinierter Effekt von sowohl verminderter Bindung an Kollagen III, als auch der Inhibierung der VWF-Thrombozyten GPIb Rezeptor Interaktion. Die freien Sulfhydrylgruppen wurden in der N-terminalen TIL und D3 Domänen, D4 Domäne und in der größten Menge in den C-terminalen C-Domänen identifiziert. Vier der freien Sulfhydrylgruppen der VWF C-Domäne wurden im Kollagen III-gebundenem VWF in reduzierter Menge gefunden, was auf die Bildung neuer Disulfidbrücken hindeutet. Zusammenfassend, deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass freie Sulfhydrylgruppen auf der Oberfläche des plasmatischen VWF eine wichtige Funktion in der primären Hämostase erfüllen.

The present thesis focuses on the structure and function of Willebrand factor (VWF), a blood glycoprotein involved in the primary haemostasis process. Aim of this work was identification of the function, amount and distribution of free thiol groups in plasmatic VWF. The function of free thiol groups in VWF under high physiological shear stress conditions, as well as the effect on the key interactions involved in VWF-mediated platelet adhesion ought to be investigated. Further aim was the determination of distribution of unpaired cysteine residues in VWF multimers and the exact localisation of unpaired cysteine residues within a VWF monomer, as well as the identification of possible differences in free thiol group content between in-solution and collagen type III bound VWF. The blockade of free thiol groups in plasma derived VWF caused substantial decrease in VWF activity with respect to mediation of platelet adhesion under physiological shear stress conditions. The decrease in platelet adhesion in the flow chamber assay was a combined effect of VWF-collagen type III and VWF-platelet GPIb receptor interaction inhibition. Free thiol groups were identified in N-terminal TIL and D3 domains, D4 domain and the highest amount was identified in C-terminal C-domains. From a total of nineteen free thiol groups, the accessibility of four was reduced after VWF binding to collagen type III, indicating new disulfide bond formation upon binding to collagen. In summary, the results suggest a significant regulatory function of free thiol groups on VWF activity in primary haemostasis.