Entwicklung und Validierung eines Direkt-Radioimmunoassays zur quantitativen Bestimmung von Gesamt-Melatonin (N-Acetyl-5-methoxytryptamin) bei unterschiedlichen Mauslinien

Abstract

Die bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von Melatonin bei verschiedenen Mausmodellen waren überwiegend ungeeignet oder aufwendig in der Durchführung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein einfacher, sensitiver und spezifischer Radioimmunoassay (RIA) für die quantitative Detektion von Gesamt-Melatonin in Serum- bzw. Plasmaproben bei unterschiedlichen Mauslinien entwickelt. Durch die Herstellung einer spezifischen Mausausgleichsmatrix wird die Beeinflussung von Messergebnissen aufgrund unterschiedlicher Zusammensetzung zwischen Standards und Probenmatrix verringert. Mit einem geeigneten Syntheseverfahren zur Herstellung eines Immunisierungskonjugats ist es gelungen, einen spezifischen Antikörper gegen Melatonin zu generieren. Der Test erfasst das gesamte Melatonin, weil mit der Einführung eines Enzymschritts das an Proteine gebundene Melatonin getrennt wird. Die Markierung mit [125I]-Bolton-Hunter-Reagenz ist ein effektives Verfahren zur Einführung radioaktiven Iods in eine Vielzahl verschiedener Proteine, Peptide und Moleküle mit Amino-Gruppen. Die geforderten Akzeptanzkriterien für die Validierungsparameter wurden erfüllt. Ein diurnaler Rhythmus des Melatonins in Serum- und Plasmaproben von Kontroll-Mäusen konnte erfasst werden. Die Durchführung beim „Direkt-RIA“ ist gegenüber etablierten Extraktionsmethoden wie Flüssig-Flüssigund Festphasenextraktion sowie anschließendem RIA, wesentlich schneller. Mit dem „Direkt-RIA“ konnte der Nachweis einer nächtlich erhöhten Melatoninsynthese bei vier unterschiedlichen Mauslinien erbracht werden. Die Melatonin-Bestimmungen mittels ELISA- oder HPLC-Techniken scheiterten bisher am Gebrauch eines hohen Probenvolumens und geringerer Sensitivität. Zusammenfassend können folgende Vorteile des „Direkt-RIA“ hervorgehoben werden: Einfache und schnelle Durchführung des Assays, höhere Anfangsaktivität des Tracers, weiter Arbeitsbereich, hohe Spezifität des Antikörpers, niedriges Probenvolumen und hohe Sensitivität. Tagesrhythmen von Melatonin mit erhöhten Melatoninwerten in der Nacht können mit dem „Direkt-RIA“ bei unterschiedlichen Mauslinien nachgewiesen werden.