Process intensification for the production of MVA and influenza A virus in high density suspension cultures of AGE1.CR.pIX cells

Abstract

Industrial cell culture-based processes have reached a maturity level, thanks to economies of scale, an ever-growing industrial competition and the development of innovative process technologies. In this regard, process intensification has become an imperative area of study during the past years, especially in monoclonal antibody production. For example, process intensification approaches using high seeding concentrations are used to increase the manufacturing capacity and the overall productivity. These applications have become every time more accessible due to the appearance of new and robust cell expansion systems that enable very high cell densities. While technology and know-how have seen great advances in the monoclonal antibody field, process intensification for viral vaccine production has attracted more interest only recently. The present work aimed at developing an intensified high cell density processes for the production of two viruses with high relevance as viral vaccines: modified vaccinia Ankara (MVA) virus and influenza A virus (IAV). MVA is a highly attenuated virus derived from the vaccinia virus, which was used as vaccine to eradicate smallpox. Besides its potential application as next-generation smallpox vaccine, MVA is currently tested as viral vector against infectious diseases and cancer. In this work, the strain MVA- CR19 (kindly provided by ProBioGen AG) was used due to its capacity to propagate efficiently in suspension cell cultures. In addition, the IAV strain A/PR/8/34 (H1N1), used for the production of seasonal influenza vaccines, was applied as a model for influenza virus production. The avian suspension cell line AGE1.CR.pIX® (kindly provided by ProBioGen AG) was used as production platform to study the propagation of the MVA-CR19 and A/PR/8/34 (H1N1) at high cell densities. AGE1.CR.pIX® cells (here abbreviated as CR.pIX) are permissive for MVA-CR19 virus and for A/PR/8/34 (H1N1), yielding titers in the order of 108 plaque forming units (pfu) per mL and around 2.4 log10 HA units (HAU) per 100 µL, respectively, in conventional batch processes. For the intensification of the typical production process for MVA and IAV via high cell density cultures, two key aspects were addressed. On the one hand, the optimal cell expansion to high cell concentrations in the seeding step using a perfusion system. On the other hand, the definition of strategies for optimal virus propagation at high cell densities to higher titers maintaining or even improving specific and volumetric productivity. For the cell expansion to high cell densities, a perfusion process was established in shake flasks (semi- perfusion) and a 1 L bench-top bioreactor. Here, the medium consumption was reduced to the minimum possible based on the glucose uptake rate, i.e. applying a constant specific perfusion rate of 0.06 nL/(cell×d). Under these conditions, cells grew exponentially at a mean specific cell growth rate of 0.026 1/h and achieved viable cell concentrations > 80 × 106 cells/mL in around 8 d. This was a key aspect to define, since this medium saving had a strong impact on the volumetric productivity at the end of the virus propagation phase. In a next step, several strategies for optimal MVA-CR19 virus propagation at cell densities between 40 and 60 × 106 cells/mL where analyzed in multiple shake flask cultivations. A simple fed-batch process using a medium with 10-times concentrated glucose and glutamine did not improve virus titers. In contrast, strategies with medium exchange and a fed-batch process using basal medium increased virus titers even above a factor of 10 compared to the standard batch process at low cell densities, maintaining comparable cell-specific yields. A hybrid strategy comprising a fed-batch process followed by a medium exchange regime provided the highest yields in shake flasks. This strategy was later scaled-up to a controlled 1 L bench-top bioreactor and adapted as a hybrid fed-batch/perfusion strategy. Under these conditions, MVA-CR19 virus titers up to 1 × 1010 pfu/mL were obtained, which represented a 10- to 100-fold increase (compared to typical reported titers for MVA), with cell-specific yields comparable to other production platforms (such as chicken embryo fibroblasts) and volumetric productivities 10 times higher than for reported conventional batch processes. The hybrid fed-batch/perfusion strategy was also evaluated for the propagation of IAV. Compared to the reference process at conventional cell densities, virus titers increased 10-fold from 2.23 to 3.27 log10 (HAU/100 μL), which corresponded well to the same increase in cell concentration. This way, cell-specific yield and volumetric productivity were maintained constant, and the cell-density effect known for perfusion processes at high cell density was circumvented. Concerning process monitoring and control, this study explored the implementation of three applications. First, an alternative pH-based perfusion control, based on the lactate accumulation and medium acidification, was applied to propagate cells up to 25 × 106 cells/mL with cell growth rates comparable to the strategy based on a fixed specific perfusion rate. Second, an accurate on-line capacitance-based monitoring of viable cell concentrations was possible up to late stage of MVACR19 virus and IAV infection. And third, an insight in the dynamics of virus propagation was possible by identifying regular changes in dielectric properties (measured on-line) of the infected cells. Overall, these strategies showed a very high potential for development and implementation as Process analytical technology (PAT) tools for high cell density vaccine production processes. In summary, this work identifies the intrinsic constraints of virus production in batch mode and applies solutions to circumvent their negative effects for virus propagation at high cell densities. It can also serve as a starting point to develop and establish fully or semi-continuous and highly productive production processes at high cell densities using appropriate retention systems. In addition, with the use of on-line monitoring systems, these complex processes can be simplified and support vaccine manufacturing in an industrial scale.

Industrielle zellkulturbasierte Prozesse haben aufgrund von Skaleneffekten, einem immer stärker werdenden industriellen Wettbewerb und der Entwicklung innovativer Prozesstechnologien einen hohen Reifegrad erreicht. In diesem Zusammenhang ist die Prozessintensivierung in den letzten Jahren zu einem wichtigen Thema geworden, insbesondere bei der Produktion monoklonaler Antikörper. So werden beispielsweise Prozessintensivierungsansätze mit hohen Seeding-Konzentrationen eingesetzt, um die Herstellungskapazität und die Gesamtproduktivität zu erhöhen. Diese Anwendungen sind durch das Aufkommen neuer und robuster Zellexpansionssysteme, die sehr hohe Zelldichten ermöglichen, immer zugänglicher geworden. Während die Technologie und das Wissen im Bereich der monoklonalen Antikörper große Fortschritte gemacht haben, ist die Prozessintensivierung für die Produktion viraler Impfstoffe erst seit Kurzem in den Fokus des Interesses gerückt. Die vorliegende Arbeit zielte auf die Entwicklung eines intensivierten Hochzelldichteprozesses für die Produktion zweier Viren mit hoher Relevanz als virale Impfstoffe: das Modified-Vaccinia-Ankara-Virus (MVA) und das Influenza-A-Virus (IAV). MVA ist ein hoch abgeschwächtes Virus, das vom Vaccinia-Virus abgeleitet ist, welches als Impfstoff zur Ausrottung der Pocken verwendet wurde. Neben seiner potenziellen Anwendung als Pockenimpfstoff der nächsten Generation wird MVA derzeit als viraler Vektor gegen Infektionskrankheiten und Krebs getestet. In dieser Arbeit wurde der Stamm MVA-CR19 (freundlicherweise von der ProBioGen AG zur Verfügung gestellt) verwendet, da er sich in Suspensionszellkulturen effizient vermehren kann. Zusätzlich wurde der IAV-Stamm A/PR/8/34 (H1N1), der für die Produktion von saisonalen Grippeimpfstoffen verwendet wird, als Modell für die Influenzavirusproduktion eingesetzt. Die aviäre Suspensionszelllinie AGE1.CR.pIX® (freundlicherweise von der ProBioGen AG zur Verfügung gestellt) wurde als Produktionsplattform verwendet, um die Vermehrung von MVA-CR19 und A/PR/8/34 (H1N1) bei hohen Zelldichten zu untersuchen. AGE1.CR.pIX®-Zellen (hier abgekürzt als CR.pIX) sind permissiv für das MVA-CR19-Virus und für A/PR/8/34 (H1N1) und liefern in konventionellen Batch-Prozessen Titer in der Größenordnung von 108 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro mL bzw. etwa 2,4 log10 HA-Einheiten (HAU) pro 100 μL. Für die Intensivierung des typischen Produktionsprozesses für MVA und IAV über Hochzelldichtekulturen wurden zwei Schlüsselaspekte adressiert. Dies betraf einerseits die optimale Zellexpansion auf hohe Zellkonzentrationen im Seeding- Schritt unter Verwendung eines Perfusionssystems und andererseits die Definition von Strategien für eine optimale Virusvermehrung bei hohen Zelldichten zu höheren Titern unter Beibehaltung oder sogar Verbesserung der spezifischen und volumetrischen Produktivität. Für die Zellexpansion zu hohen Zelldichten wurde ein Perfusionsverfahren in Schüttelkolben (Semi- Perfusion) und einem 1-Liter-Tischbioreaktor etabliert. Dabei wurde der Verbrauch des Mediums, welches an die Aufnahmerate von Glukose angepasst wurde, auf das mögliche Minimum reduziert, d. h. es wurde eine konstante spezifische Perfusionsrate von 0,06 nL/(Zelle×d) angewendet. Unter diesen Bedingungen wuchsen die Zellen exponentiell mit einer mittleren spezifischen Zellwachstumsrate von 0,026 1/h und erreichten lebensfähige Zellkonzentrationen > 80 × 106 Zellen/mL in ca. acht Tagen. Dies war ein zentraler Aspekt, den es zu definieren galt, da diese Medieneinsparung einen starken Einfluss auf die volumetrische Produktivität am Ende der Virusvermehrung hatte. In einem nächsten Schritt wurden verschiedene Strategien zur optimalen MVA-CR19- Virusvermehrung bei Zelldichten zwischen 40 und 60 × 106 Zellen/mL in mehreren Kultivierungen in Schüttelkolben analysiert. Ein einfacher Fed-Batch-Prozess unter Verwendung eines Mediums mit 10- fach konzentrierter Glukose und Glutamin führte zu keiner Verbesserung der Virustiter. Im Gegensatz dazu erhöhten Strategien mit einem Wechsel des Mediums und ein Fed-Batch-Prozess unter Verwendung von einem Basalmedium die Virustiter sogar mit einem Faktor größer als 10 im Vergleich zum Standard-Batch-Prozess bei niedrigen Zelldichten, wobei vergleichbare zellspezifische Ausbeute erhalten blieben. Eine hybride Strategie, bestehend aus einem Fed-Batch-Prozess gefolgt von einem System zum Austausch des Mediums, lieferte die höchsten Ausbeute in Schüttelkolben. Diese Strategie wurde später auf einen kontrollierten 1-Liter-Tisch-Bioreaktor hochskaliert und als hybride Fed- Batch/Perfusionsstrategie angepasst. Unter diesen Bedingungen wurden MVA-CR19-Virustiter bis zu 1 × 1010 pfu/mL erzielt, was einer 10- bis 100-fachen Steigerung (im Vergleich zu typischen berichteten Titern für MVA) entspricht, mit zellspezifischen Ausbeuten, die mit anderen Produktionsplattformen (wie z. B. Hühnerembryo-Fibroblasten) vergleichbar sind, und volumetrischen Produktivitäten, die 10-mal höher sind als bei berichteten herkömmlichen Batch-Prozessen. Die hybride Fed-Batch/Perfusionsstrategie wurde auch für die Vermehrung von IAV evaluiert. Im Vergleich zum Referenzprozess bei konventionellen Zelldichten stiegen die Virustiter um das 10- fache von 2,23 auf 3,27 log10 (HAU/100 μL), was gut mit der gleichen Erhöhung der Zellkonzentration korrespondierte. Auf diese Weise wurden die zellspezifische Ausbeute und die volumetrische Produktivität konstant gehalten, und der für Perfusionsprozesse bekannte Zelldichte- Effekt bei hoher Zelldichte umgangen. In Bezug auf die Prozessüberwachung und -steuerung wurde in dieser Studie die Implementierung von drei Anwendungen untersucht. Erstens wurde eine alternative pH-basierte Perfusionskontrolle, die auf der Laktatakkumulation und der Versauerung des Mediums basiert, angewandt, um Zellen bis zu 25 × 106 Zellen/mL mit Zellwachstumsraten zu vermehren, die mit der Strategie vergleichbar sind, die auf einer festen spezifischen Perfusionsrate basiert. Zweitens war eine genaue kapazitätsbasierte Online-Überwachung der Konzentrationen lebensfähiger Zellen bis zum späten Stadium der MVACR19- Virus- und IAV-Infektion möglich. Und drittens war ein Einblick in die Dynamik der Virusvermehrung möglich, indem regelmäßige Änderungen der dielektrischen Eigenschaften (online gemessen) der infizierten Zellen identifiziert werden konnten. Insgesamt zeigten diese Strategien ein sehr hohes Potenzial für die Entwicklung und Implementierung als Werkzeuge der Prozessanalytischen Technologie (PAT) für Produktionsprozesse von Impfstoffen mit hoher Zelldichte. Zusammenfassend identifiziert diese Arbeit die intrinsischen Beschränkungen der Virusproduktion im Batch-Modus und wendet Lösungen an, um deren negative Auswirkungen für die Virusvermehrung bei hohen Zelldichten zu umgehen. Sie kann auch als Ausgangspunkt dienen, um voll- oder halbkontinuierliche und hochproduktive Produktionsprozesse bei hohen Zelldichten unter Verwendung geeigneter Rückhaltesysteme zu entwickeln und zu etablieren. Darüber hinaus können diese komplexen Prozesse durch den Einsatz von Online-Überwachungssystemen vereinfacht werden und die Impfstoffherstellung im industriellen Maßstab unterstützen.