Metaproteomanalyse methanogener Mikrobiome aus Anreicherungskulturen im Labormaßstab

Abstract

Die Funktionsträger des anaeroben Abbaus von Biomasse in Biogasanlagen (BGA) sind komplexe mikrobielle Gemeinschaften, sogenannte Mikrobiome, deren umfassende Analyse auf strukturellem und funktionellem Niveau herausfordernd ist. Unter Laborbedingungen angereicherte Mikrobiome sind weniger komplex. Die geringere Anzahl an Organismen erleichtert die Analyse mittels moderner, massenspektrometrischer Methoden der Metaproteomanalytik. Basierend auf der Metaproteomanalyse lassen sich grundlegende Funktionen der reduzierten Mikrobiome sowie die entsprechenden stöchiometrischen Netzwerkmodelle ableiten und mittels experimenteller Daten validieren. Im Rahmen einer ersten Reaktorstudie wurden sechs parallele Laborreaktoren (R1-R6) mit Schlamm aus einer industriellen BGA inokuliert und mit synthetischem Medium kultiviert, um die Entwicklung angereicherter Mikrobiome unter definierten Laborbedingungen zu erreichen. Während der ersten drei Monate verhielten sich alle Reaktoren bezüglich Biogas- Bildungsraten, Methanausbeuten, pH-Werten und der Konzentrationen flüchtiger organischer Säuren (FOS) sehr ähnlich. Nach Erhöhung der Prozesstemperaturen (R3, R4) und der Stickstofffracht im Medium (R5, R6) zeigten sich deutliche Auswirkungen auf die Prozesse. Nach vorübergehender Akkumulation von Acetat und Propionat in R3 und R4 (von <5 mM auf 10-20 mM) sank die FOS-Konzentration in R4 nach wenigen Wochen wieder auf das Ausgangsniveau, während diese in R3 erhöht blieb und in einem deutlich niedrigeren pH-Wert resultierte (pH 6,5-6,9). R5 und R6 zeigten erhöhte Ammoniakkonzentrationen (>1 gNH3 L-1), pH-Werte (pH 7,5-8,0), Acetatkonzentrationen (>10 mM) und sinkende Biogas-Bildungsraten. Obwohl die Prozessparameter der biologischen Replikate sehr ähnlich waren, zeigten die Metaproteomanalysen und die Analysen terminaler Restriktionsfragmentlängen- Polymorphismen deutliche Unterschiede der strukturellen und funktionellen Zusammensetzungen der jeweiligen Mikrobiome. Trotz definierter Laborbedingungen stellten sich offenbar multiple stabile Gleichgewichtszustände ein, ohne dass die Biogasproduktion beeinträchtigt wurde. Diese multiplen stabilen Gleichgewichtszustände sind vermutlich ein Grund, warum Mikrobiome landwirtschaftlicher BGA trotz ähnlicher Prozessbedingungen variieren. Während einer zweiten Studie wurden zwei kontinuierlich betriebene 1,5 L Laborreaktoren genutzt, um durch die anaerobe Umwandlung von Ethanol zu Methan (CH4) und Kohlenstoffdioxid (CO2) weniger komplexe Mikrobiome bei verschiedenen hydraulischen Verweilzeiten von 78,6-24,1 d zu untersuchen. Die Prozessparameter eingestellter Gleichgewichtszustände wurden bestimmt und die Mikrobiome mittels Metaproteomanalyse charakterisiert. Die erzeugten Daten wurden für die Validierung und Verbesserung eines bestehenden stöchiometrischen Netzwerkmodells herangezogen, das aus den Netzwerken repräsentativer Organismen für verschiedene relevante Stoffwechselwege zusammengesetzt wurde. Der vom Modell vorgegebene große Lösungsraum mit verschiedenen Wegen zur Umwandlung von Ethanol zu CH4 und CO2 konnte mit Hilfe der Metaproteomanalysen deutlich eingeschränkt werden. Die Ethanoloxidation erfolgte ausschließlich über Acetat und Wasserstoff (H2), nicht aber über Propionat. Weiterhin wurden keine Hinweise auf Homoacetogenese gefunden. Anstelle der erwarteten Methanosarcinaceae-Spezies, welche sowohl acetoklastische als auch hydrogenotrophe Methanogenese betreiben können, wurden Methanosaetaceae-Spezies als strikt acetoklastische Methanogene identifiziert, während der entstandene H2 von strikt hydrogenotrophen Methanogenen verwertet wurde. Die Präsenz von Methanosaetaceae wies auf eine erforderliche Erweiterung des Modells um einen entsprechenden Organismus hin. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die Notwendigkeit zur Erzeugung geeigneter experimenteller Daten zur Validierung mathematischer Modelle. Weiterhin konnte erstmalig gezeigt werden, dass Metaproteomdaten nicht nur für die Analyse der Biomassezusammensetzung geeignet sind, sondern auch wertvolle Impulse für die Verbesserung und Erweiterung mathematischer Netzwerkmodelle mikrobieller Gemeinschaften liefern.

Anaerobic digestion (AD) of agricultural biomass in biogas plants (BGP) is carried out by complex microbial communities - so called microbiomes. Due to their taxonomic complexity, comprehensive structural and functional analyses of these microbiomes are challenging. Microbiomes enriched under laboratory conditions are fully functional in terms of AD, but less complex, facilitating analyses using mass spectrometry based metaproteomics approaches. Metaproteomics analyses these microbiomes allowing evaluation of basic metabolic functions and supports construction as well as validation of stoichiometric network models using experimental data. In a first study, six laboratory-scale BGP (R1-R6) were inoculated with sludge from an agricultural-scale BGP and operated in parallel by feeding synthetic medium in order to adapt microbiomes to defined laboratory conditions. Biogas formation rates, methane yields, pH values, and concentrations of volatile fatty acids (VFA) were similar during the first three months of cultivation. Switching to higher process temperatures (R3, R4) and higher nitrogen loads in the medium (R5, R6), resulted in significant changes of respective processes. Both R3 and R4 accumulated acetate and propionate (<5 mM to 10-20 mM). This led to a low pH of 6.5-6.9 in R3, whereas R4 slowly recovered to initial VFA concentrations. R5 and R6 showed increased ammonia concentrations (>1 gNH3 L-1) and pH values (pH 7.5-8.0), acetate concentrations of >10 mM as well as decreasing biogas productions. Although process parameters between biological replicates were similar, analyses of metaproteomes and terminal restriction fragment length polymorphisms revealed strong differences in respective structural and functional aspects. Even though BGPs were operated under defined laboratory conditions, multiple steady states in community compositions developed without impairing biogas production. Eventually, these multiple steady states might also explain variations in microbiomes derived from agricultural BGPs operated under similar process conditions. In a second study, further enrichment was carried out in two 1.5 L continuously stirred tank reactors in order to investigate less complex microbiomes converting ethanol anaerobically into CH4 and CO2 at different hydraulic retention times ranging from 24.1 d to 78.6 d. Steadystate process parameters were determined and respective microbiomes characterized by metaproteomics analyses. Derived data were used to extend and validate an established stoichiometric network model that was assembled from selected microorganisms, each representing certain metabolic pathways involved in methane formation. By confirming the presence of specific pathways, the space of potential solutions allowed by the model for the conversion of ethanol to methane (CH4) and carbon dioxide (CO2) was highly constrained. Oxidation of ethanol was solely observed using acetate and hydrogen (H2), but not using propionate. Furthermore, no evidence for homoacetogenic activity was found. Instead of Methanosarcinaceae species capable of performing both aceticlastic and hydrogenotrophic methanogenesis, strict aceticlastic Methanosaetaceae species were identified. Produced H2 was exclusively consumed by strict hydrogenotrophic methanogens. Identification of Methanosaetaceae in these microbiomes demands an extension of the current model community. Altogether, results of this study underline the necessity to apply experimental data for validation of community models. Firstly, in addition to analysing community compositions, metaproteomics has been proven to contribute for validation or even extension of community models of microbial communities.