Evaluation of MDCK suspension cell lines for influenza A virus production : media, metabolism, and process conditions

Abstract

Infektionen mit Influenza-Viren sind nicht nur eine Bedrohung für die Gesundheit von Millionen Menschen, sondern haben auch erhebliche Auswirkungen auf die lokale und globale Wirtschaft. Die Kontrolle und Prävention von Grippe Epidemien hängt von der Verfügbarkeit wirksamer und sicherer saisonaler- und pandemischer Impfstoffe ab, welche hauptsächlich aus inaktivierten Influenzaviruspartikeln hergestellt werden. Die derzeitigen Produktionsprozesse basieren hierbei stark auf Hühnereiern als Substrat für die Virusvermehrung. Trotz der Unterschiede in den Oberflächenantigenen der saisonalen Virus-Subtypen, sind die Impfstoffhersteller gut gerüstet, um der periodischen Nachfrage nach Impfstoffdosen nach zu kommen. Angesichts der steigenden Nachfrage nach Grippeimpfstoffen in den Schwellenländern und des Bedarfs an Milliarden von Impfstoffdosen im Falle einer plötzlichen Pandemie, könnte die traditionelle Impfstoffherstellung jedoch an ihre Grenzen stoßen. Der Einsatz von zellkulturbasierten Produktionsprozessen ermöglicht eine schnelle Fertigung sowohl in großtechnischen als auch in mittelgroßen Anlagen, unabhängig von Hühnereiern. Um eine effiziente zellkulturbasierte Fertigung zu ermöglichen, sind optimierte Produktionsprozesse erforderlich. Hier können neue Zellkulturmedien, gut charakterisierte Produktionszelllinien und neue Zellkulturprozesstechnologien helfen, Produktionsbarrieren zu überwinden und sichere, effiziente und kostengünstige Grippeimpfstoffe anzubieten. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Evaluierung von MDCK-Suspensionszelllinien für die Herstellung von zellkulturbasierten Grippeimpfstoffen. Wachstum, Stoffwechsel und Produktivität verschiedener MDCK-Suspensionszelllinien in einer Variation der Kultivierungsmedien wurden bewertet, um einen Batchprozess zu entwickeln, welcher bei sehr hohen Zellkonzentrationen maximale Virusausbeuten ermöglicht. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen der Influenzavirusinfektion auf den zentralen Energie- und Kohlenstoffmetabolismus der MDCKSuspensionszellen analysiert, um potenzielle metabolische Engpässe zu identifizieren, die die Replikation des Influenzavirus begrenzen könnten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine MDCK-Suspensionszelllinie an ein neues Kultivierungsmedium adaptiert, welches ein schnelleres Zellwachstum, eine höhere Zellkonzentration und einen höheren Influenzavirus Titer als vergleichbare Medien ermöglichte. MDCK-Zellen wuchsen als Einzelzellensuspension mit einer Verdoppelungszeit von weniger als 20 Stunden und erreichten Zellkonzentrationen von über 10 × 106 Zellen/mL im Batch-Betrieb. Influenza A-Virus Titer von Batchinfektionen, lagen bei 3,6 lg(HAU) für die gesamten Viruspartikel und 109 TCID50/mL für infektiöse Viruspartikel. Zusätzlich wurde eine Kultivierung mit hoher Zelldichte im Semi-Perfusionsmodus durchgeführt, wobei Zellkonzentrationen von bis zu 60 × 106 Zellen/mL möglich waren. Mit dieser Technologie wurden Virustiter von 4,5 lg(HAU) erreicht, die höchsten bisher in Zellkultur gemessenen Titer. Im zweiten und dritten Teil dieser Arbeit wurden vier MDCK Suspensionszelllinien verglichen, um die Auswirkungen von Medium und Zelllinie auf das Zellwachstum, den Stoffwechsel und die Virusproduktion zu untersuchen. Die MDCK-Zelllinie aus der amerikanischen Zellbank (ATCC), kultiviert in einem neuen chemisch definierten Medium, war den anderen getesteten Zelllinien deutlich überlegen. Dies führte zu der Entwicklung eines skalierbaren Fed-Batch-Prozesses für die Herstellung von Grippeimpfstoffen. Durch optimale Skalierbarkeit, sehr guten Wachstumseigenschaften, optimierter Mediumsnutzung und einer maximalen Zellkonzentration von 12 × 106 Zellen/mL, waren sehr hohe Influenzavirus-Titer von 3,6 lg(HAU) und 2 × 109 TCID50/mL möglich. Eine geschätzte Produktivität von bis zu 600 Impfstoffdosen pro Liter innerhalb von nur 4 bis 5 Tagen Kultivierungszeit machte diesen Prozess sowohl im Vergleich zu anderen zellbasierten Prozessen als auch gegenüber der eierbasierten Produktion überlegen. Der letzte Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die detaillierte Analyse des Stoffwechsels der MDCK-Suspensionszelle während des Zellwachstums und nach der Infektion mit Influenzaviren. Extra- und intrazelluläre Metaboliten und die Replikation des Influenzavirus bei Infektionen mit hoher MOI wurden in zwei Versuchsreihen untersucht. Eine synchrone Zellinfektion führte zu einem schnellen Stopp des Zellwachstums. Nach einem kurzen Zeitintervall der Virusvermehrung von nur 12 Stunden, setzte die virusinduzierte Apoptose ein, welch zu einem schnellen Zelltod führte. Innerhalb dieser Zeit waren sowohl der zellspezifische Glukoseverbrauch als auch die Laktatsekretion leicht erhöht. Es wurden einige Veränderungen in den intrazellulären Metabolitpools der Glykolyse gefunden, was auf eine Wirkung der Virusinfektion auf diesen Stoffwechselweg hinweist. Für die Energiemetaboliten (ATP, ADP. AMP), die Energieladung und die Metabolitpools des TCA-Zyklus wurden jedoch keine größeren Veränderungen gefunden. Insgesamt gibt diese Arbeit einen tieferen Einblick in den Stoffwechsel von MDCKSuspensionszellen, insbesondere nach der Infektion mit Influenzaviren. Obwohl kein klarer metabolischer Engpass für die Vermehrung der Influenzaviren identifiziert werden konnte, gab es einige Hinweise auf eine veränderte Glykolyse in infizierten MDCK-Suspensionszellen. Insgesamt waren die metabolischen Auswirkungen von Influenza-A-Virusinfektionen jedoch begrenzt. Darüber hinaus wurden zwei neuartige, hochproduktive Verfahren zur Herstellung von Influenzaviren entwickelt. Hier wurden, mittels neuer Kultivierungsmedien, MDCK Suspensionszelllinien generiert, welche in Kombination mit modernster Kultivierung- und Prozesstechnologie den Virustiter und die Produktivität deutlich erhöhten. Diese Arbeit könnte der erste Schritt zu einem verbesserten, weit verbreiteten und kostengünstigen MDCK-basierten Grippeimpfstoff sein, der idealerweise in einem intensivierten Verfahren mit hoher Zelldichte hergestellt wird.

Human influenza virus infections are not only a threat for the health of millions of people but have a significant impact on local and global economies as well. Control and prevention of rapid influenza spread depend on the availability of efficacious and safe seasonal and pandemic vaccines, made primarily from inactivated influenza virus particles. Current influenza virus production processes rely heavily on embryonated chicken eggs as substrate for virus propagation. Manufacturers are well prepared to respond to seasonal demands for vaccine doses, despite the differences in surface antigens and virulence of virus subtypes. However, with raising demand for influenza vaccines in developing countries and the need for billions of vaccine doses in case of a sudden pandemic, traditional vaccine manufacturing might reach its limits. With the use of cell culture-based facilities, egg independent virus production enables fast manufacturing both in large scale and medium sized single use facilities. To enable efficient cell culture-based manufacturing, optimized production processes are needed. Here, cell culture media, well characterized production cell lines, and state of the art cell culture process technologies can help to overcome production barriers and provide safe, efficient, and affordable influenza vaccines. This work focuses on the evaluation of MDCK suspension cell lines for the production of cell culturebased influenza vaccines. Growth, metabolism and productivity of different MDCK suspension cell lines in various cultivation media were evaluated to suggest an improved, highly productive process with very high cell concentrations. Additionally, effects of influenza virus infection on the central energy and carbon metabolism on the MDCK suspension cells was analyzed to identify potential metabolic bottleneck that could limit influenza virus replication. In the first part of this thesis a MDCK suspension cell line was adapted to a new cultivation medium which enabled faster cell growth, higher cell concentration and higher influenza virus titer. MDCK cells grew as single cell suspension with a doubling time of less than 20 h achieving cell concentrations over 10 × 106 cells/mL in batch mode. Influenza A virus titer obtained in batch infections were 3.6 lg(HAU) for total- and 109 TCID50/mL for infectious virus particles, respectively. Additionally, high cell density cultivations were performed in semi-perfusion mode, where cell concentrations of up to 6 × 10 7cells/mL were possible. Using this technology a virus titer of 4.5 lg(HAU) were reached, which was the highest titer ever reported so far. In the second and third part of this thesis, four MDCK suspension cell lines were evaluated to investigate the impact of medium, and cell line on the cell growth, metabolism and virus production. The MDCK cell line from the American cell bank (ATCC), cultivated in a new chemically defined medium was identified to be superior to the other tested cell lines and media. The superior characteristics of this cell line were used to design and evaluate a scalable fed-batch process for the manufacturing of influenza vaccines. Due to optimal scalability, superior growth, optimized medium use and maximal cell concentration of 12 × 106 cells/mL very high influenza virus titers of 3.6 lg(HAU) and 2 × 109 TCID50/mL were achieved. An estimated productivity of up to 300 vaccine doses per liter of harvest broth within 4 to 5 days of manufacturing made this process superior not only to other cell-based processes but to egg-based production as well. The last part of this work focused on the deeper analysis of the metabolism of MDCK suspension cell during a cell growth phase and upon influenza virus infection. Extra- and intracellular metabolites and influenza virus replication in high MOI infections were monitored in two sets of experiments. A synchronous cell infection stopped cell growth almost immediately limiting virus replication to about 12 h until virus-induced apoptosis resulted in fast cell death. Within this time period cell specific glucose consumption as well as lactate secretion was slightly increased. Some alterations were found in the intracellular metabolite pools of the lower glycolysis indicating an effect of virus infection on this pathway. However, no changes were found for energy metabolites (ATP, ADP. AMP), energy charge and the metabolite pools of the TCA cycle. Overall, this thesis gives a deeper insight in the metabolism of MDCK suspension cells, especially upon influenza virus infection. Even though no clear metabolic bottleneck has been identified, there was some evidence for an altered glycolysis in infected MDCK suspension cells. However, the overall metabolic effects of influenza A virus infections were limited. Furthermore, two novel highly productive processes for influenza vaccine manufacturing were designed. Here, new cultivation media for MDCK suspension was combined with modern cultivation and process technologies to maximize virus titers and productivity. This work might be the first step towards an improved, widely available, and affordable MDCK-based influenza vaccine ideally produced in intensified high cell density processes.