Untersuchungen zur Synthese von Biopolymeren unter Einsatz von Biokatalysatoren in parallelen Multienzym‐Multisubstrat‐Reaktionen

Abstract

In den letzten Jahren hat sich der Bedarf an Biopharmazeutika stark erhöht. Dabei sind etwa 70 % der Biopharmazeutika N-glykosyliert und weisen Mikroheterogenitäten auf. Um die Funktion von N‐Glykanen sowohl bei gesunder Physiologie als auch in Krankheitszuständen untersuchen zu können, werden homogene N‐Glykane benötigt. Eine Möglichkeit, diese kostengünstig herzustellen, ist die in vitro‐Synthese. Eine Herausforderung stellt dabei die Bereitstellung der Enzyme und Substrate dar. Dafür müssen rekombinante Expressionssysteme etabliert und Glykan‐Donatoren als aktivierte Nukleotid‐Zucker bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, das Glykokonjugat Phytanyl‐PP‐(GlcNAc)2Man1 unter Verwendung einer rekombinanten, gereinigten β1,4‐Mannosyltransferase enzymatisch in vitro im präparativen Maßstab herzustellen. Zudem wurden Enzyme gereinigt, die das kostenintensive Donorsubstrat GDP‐Mannose aus günstigen Ausgangsstoffen synthetisieren und anfallende Nebenprodukte regenerieren.

In recent years the demand for biopharmaceuticals steadily increased. 70 % of the biopharmaceuticals are N-glycosylated and show microheterogeneities. To investigate the function of N‐glycans for both normal and pathogenic state, homogeneous N‐glycans are needed. One cost-effective opportunity to provide these glycans is the in vitro‐synthesis. The provision of the necessary enzymes and substrates is a major challenge. Therefor, recombinant expression systems need to be established and activated sugar nucleotides as glycan donors should be provided. In summary, in the course of this study the glycoconjugate Phytanyl‐PP‐(GlcNAc)2Man1 was provided by using a recombinant, purified β1,4‐Mannosyltransferase enzymatically in vitro in a preparative scale. Further investigations included the development of a synthesis and regeneration system for the expensive donor substrate GDP-Mannose with cost-efficiently implemented starting materials applying suitable, purified enzymes.