Fate of antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes in constructed wetlands

Abstract

The World Health Organization (WHO) reported that because of antibiotic resistance, diseases that were previously essentially under control may soon pose a severe global risk to human health. The current extensive release of antibiotic resistant bacteria (ARB) and their respective antibiotic resistance genes (ARG) into the environment is of significant concern. The knowledge about which factors favour the development of antibiotic resistance in clinical settings has increased in the last decades but little is known about its driving forces in the environment. The most common approaches to assess antibiotic resistance in the environment is either to isolate resistant colonies on agar plates or quantify some indicator ARG by means of quantitative PCR (qPCR). As biological contaminants, ARG exhibit different behaviour and fate in various environmental media, since their abundance and composition may change depending on the physiological status of their hosts. Therefore, knowing the ARG hosts is of interest in order to understand the mechanisms underlying the spread of ARG in the environment. Among all phenomena related to the hosts taking place in the environment, horizontal gene transfer (HGT) of ARG is of great concern because bacteria that are pathogenic but susceptible can become resistant and bacteria that were already resistant may become multi-drug resistant. Wastewater treatment plants (WWTP) represent an interface between human activities and the environment and therefore play a key role in the prevention of ARB and ARG spreading. While the total abundance of ARG decreases during wastewater treatment, an increase in the relative abundance of some ARG usually takes place in WWTP. Although quantities of some ARG significantly decrease during wastewater treatment process, the concentrations of these resistance genes in the effluent are still high. The incomplete removal of antibiotics and ARG in WWTP severely affects the receiving river, where both types of emerging pollutants are found at higher concentration in downstream waters than in samples collected upstream from the discharge point. Constructed wetlands (CW) constitute a near-natural wastewater treatment technology in operation around the world. CW are viewed both as alternative wastewater treatment option for removal of ARB and ARG and as a near natural habitat to investigate their environmental fate. Horizontal subsurface flow constructed wetlands (HSSF-CW) are the most common type of CW built worldwide due to its technical simplicity, low costs of implementation, and low energy and maintenance requirements. As oxygen is one of the main limiting factors in the removal of organic matter and ammonium through HSSF-CW, aeration of these systems constitutes an improvement for vi wastewater treatment. In this work, the effects of aeration on antibiotic resistance in CW was addressed. For that, two HSSF-CW at the Ecotechnology Research Facility in Langenreichenbach (UBZ), Germany were compared: one standard HSSF-CW (H50p) and an aerated HSSF-CW (HAp). With the aim of evaluating the performance of the aerated CW regarding removal of ARB and ARG in comparison with an standard CW and to study HGT of ARG, the antimicrobials sulfamethoxazole (SMX) and trimethoprim (TMP) were chosen. Five genes were selected: 16S rRNA gene which is useful to quantify total bacterial abundance; sul1, sul2 and dfrA1 which are ARG that give resistance to the aforementioned antibiotics and intI1, a gene which is related to ARG and mobile genetic elements (MGE). A multiphasic approach was applied, making use of culture- dependent and independent methods to analyse samples from in- and outflows as well as from internal points in both CW. Comparing in- and outflows, both CW showed higher reductions of ARG/ARB than what was observed for HSSF-CW before, and aeration was beneficial for the total reduction of ARB and ARG. ARB were identified as members of Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Aeromonas and Enterococcus, whereas ARG hosts belonged to members of Enterobacteriaceae and Aeromonas, the other two groups rarely carried them. As Escherichia coli and Aeromonas were common hosts of the selected ARG, additional analysis were carried out for this bacteria. The investigated CW showed different internal behaviour. While the trend in reduction was gradual in H50p, at the beginning of HAp high aerobic metabolism took place and an increase in intI1 and sul genes abundances was seen. Copy numbers of 16S rRNA gene remained almost constant and dfrA1 decreased, indicating that the increase in intI1 and sul genes abundances was specific. Cells carrying more than one type of class 1 integron in the first half of HAp showed higher diversity than in the inlet and the rest of HAp, accounting for a higher integrase activity. Because of their very low concentrations and the absence of statically significant differences between the CW, the presence of SMX/TMP in the media was unlikely the cause for the difference in antibiotic resistance observed between the CW, even though a synergistic effect can’t be discarded. It is known that reactive oxygen species (ROS) can increase HGT through activation of the SOS system and they are more abundant in HAp than in H50p. Based on the data from this study and on what was known from other studies, oxidative stress is proposed as an important factor for increasing HGT of ARG in wastewater treatment plants.

Die Weltgesundheitsorganisation berichtete, dass Krankheiten die zuvor im Wesentlichen unter Kontrolle standen, aufgrund von Antibiotikaresistenzen bald ein schwerwiegendes globales Risiko für die menschliche Gesundheit darstellen können. Die derzeitige weitreichende Freisetzung von Antibiotika-resistenten Bakterien (ARB) und ihrer jeweiligen Antibiotika-Resistenzgene (ARG) in die Umwelt gibt Anlass zu großer Sorge. Das Wissen darüber, welche Faktoren die Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen im klinischen Umfeld begünstigen, hat in den letzten Jahrzehnten zugenommen, während über die treibenden Kräfte in der Umwelt wenig bekannt ist. Der gebräuchlichste Ansatz zur Bewertung der Antibiotikaresistenz in der Umwelt besteht in der Quantifizierung bestimmter Indikator-ARG mittels quantitativer PCR (qPCR). Als biologische Schadstoffe weisen ARG in verschiedenen Umweltmedien ein unterschiedliches Verhalten auf, da sich ihre Häufigkeit und Zusammensetzung mit dem physiologischem Zustand ihrer Wirte ändern kann. Daher ist es wichtig, die ARG-Wirte zu kennen, um die Mechanismen zu verstehen, die der Verbreitung von ARG in der Umwelt zugrunde liegen. Unter allen in der Umwelt stattfindenden Phänomenen die sich auf die Wirte beziehen, ist der horizontale Gentransfer (HGT) von ARG der bedeutendste. Dadurch können Bakterien die pathogen, aber anfällig sind, resistent und bereits resistente Bakterien multiresistent werden. Kläranlagen bilden die Schnittstelle zwischen menschlichen Aktivitäten und der Umwelt und spielen daher eine Schlüsselrolle bei der Verhinderung der Ausbreitung von ARB und ARG. Während die Gesamtmenge an ARG in der Abwasserbehandlung abnimmt, findet in Kläranlagen normalerweise eine Zunahme der relativen Häufigkeit von einigen ARG statt. Obwohl die Mengen einiger ARG während der Abwasserbehandlung deutlich abnehmen, sind die Konzentrationen dieser Resistenzgene im Abwasser immer noch hoch. Die unvollständige Entfernung von Antibiotika und ARG in der Kläranlage wirkt sich schwerwiegend auf den aufnehmenden Fluss aus. Beide Arten von Schadstoffen kommen in höherer Konzentration in flussabwärts gelegenen Gewässern vor als in Proben, die stromaufwärts von der Einleitstelle entnommen werden. Pflanzenkläranlagen (PKA) bilden eine nahezu natürliche Abwasserbehandlungstechnologie, die weltweit eingesetzt wird. PKA werden sowohl als alternative Abwasserbehandlungsoption zur Entfernung von ARB und ARG, als auch als natürlicher Lebensraum zur Untersuchung ihres Umweltverhaltens betrachtet. Horizontal durchströmte Pflanzenkläranlagen (HDS-PKA) sind aufgrund ihrer technischen Einfachheit, niedrigen Implementierungskosten und niedrigen Energieund Wartungskosten die weltweit am häufigsten genutzte PKA. Da Sauerstoff einer der viii Begrenzungsfaktoren für die Entfernung von organischem Material durch HDS-PKA ist, stellt die Belüftung dieser Systeme eine Verbesserung für die Abwasserbehandlung dar. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der Belüftung auf Antibiotikaresistenzen in PKA untersucht. Dafür wurden eine standard HDS-PKA (H50p) und eine belüftete HDS-PKA (HAp) miteinander verglichen. Mit dem Ziel, die Leistung der belüfteten PKA hinsichtlich der Entfernung von ARB und ARG zu bewerten und die HGT von ARG in der PKA zu untersuchen, wurden die antimikrobiellen-Stoffe Sulfamethoxazol (SMX) und Trimethoprim (TMP) ausgewählt. Fünf Gene wurden ausgesucht: das 16S-rRNA-Gen, ein Gen die Gesamtbakteriengemeinschaft quantifiziert, sul1, sul2 und dfrA1 welche ARG sind die Resistenzen gegen die zuvor genannten Antibiotika geben; und intI1, ein Gen das mit ARG und mobilen genetischen Elementen (MGE) verwandt ist. Eine mehrphasige Methode wurde eingesetzt, die kulturabhängige und -unabhängige Methoden zur Analyse von Proben beim Ein- und Ausstritt, sowie von internen Punkten in beiden PKA verwendet. Beim Vergleich von Ein- und Ausströmseite zeigten beide untersuchten PKA eine stärkere Reduktion von ARG/ARB als zuvor für HDS-PKA beobachtet wurde und die Belüftung schien für den gesamten Abbau von ARB und ARG vorteilhaft zu sein. ARB wurden als Bestandteil von Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Aeromonas und Enterococcus identifiziert. Während ARG-Wirte zu Enterobacteriaceae und Aeromonas gehörten, trugen sie die anderen beiden Gruppen nur selten. Da E. coli und Aeromonas häufige Wirte des ausgewählten ARG waren, wurden zusätzliche Analysen für diese Bakterien durchgeführt. Die PKA zeigten ein unterschiedliches internes Verhalten. Während die Tendenzen zum Abbau bei H50p konstant waren, trat in dem ersten Bereich von HAp ein starker aerober Metabolismus auf und es wurde eine Zunahme der int11 und sul Gene beobachtet. Das 16S rRNA Gen blieb nahezu konstant und dfrA1 nahm ab, was darauf hindeutet, dass die Zunahme der intI1 und sul Gene Abundanzen spezifisch war. Zellen, die mehr als eine Klasse-1-Integron-Kopie trugen, zeigten im ersten Bereich von HAp eine größere Diversität als im Einlass und im Rest von HAp auf, was auf einer erhöhten Integrase-Aktivität hindeutet. Aufgrund ihrer sehr niedrigen Konzentration und des Ausbleibens der statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den PKA, war die Ursache für den beobachteten Unterschied in der Resistenz zwischen den PKA um Vorhandensein von SMX/TMP in den Medien unwahrscheinlich, obwohl ein synergistischer Effekt nicht ausgeschlossen werden kann. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können HGT durch Aktivierung des SOS-Systems erhöhen und sie sind häufiger in HAp als in H50p vorhanden. Basierend auf den Daten aus dieser Studie und auf dem, was bekannt war, wird oxidativer Stress als wichtiger Faktor für die Erhöhung der HGT von ARG in Kläranlagen vorgeschlagen.