Stöchiometrische Modellierung von mikrobiellen Gemeinschaften in Biogasanlagen

Abstract

Mikrobielle Gemeinschaften sind von zentraler Bedeutung in geochemischen Kreisläufen, verschiedenen industriellen Prozessen und für die Gesundheit des Menschen. Für ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse werden neben experimentellen Analysemethoden auch vermehrt Modelle und Simulationen eingesetzt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung mikrobieller Gemeinschaften mit Hilfe von stöchiometrischen Netzwerkmodellen. Eine Herausforderung hierbei ist die Vielzahl der beteiligten Organismen und die daraus resultierende Größe der Modelle, die zudem in der Regel bilinear sind und somit eine kompliziertere Struktur als lineare Einzelmodelle aufweisen. Als Beispiel diente der Biogasprozess, bei dem Biomasse in konsekutiven Schritten abgebaut wird. Für eine vereinfachte definierte mikrobielle Gemeinschaft wurden typische Vertreter verschiedener Abbauschritte (metabolischer Funktionen) im Prozess ausgewählt. Für diese Organismen wurden zunächst spezifische stöchiometrische metabolische Modelle erstellt und validiert. Ausgehend von den Einzelmodellen wurden kompartimentierte Gemeinschaftsmodelle erstellt. Dabei wurde ein ausbalanciertes Wachstum, bei dem alle Organismen gleich schnell wachsen, angenommen. Das resultierende bilineare Modell wurde mit nichtlinearer Optimierung untersucht und dann durch Festsetzen der Gemeinschaftswachstumsrate linearisiert, wodurch sich Standardmethoden aus dem constraint-based Modelling (z.B. Flussoptimierung) anwenden lassen. Mit den Modellen wurden Bereiche für die Komposition, für metabolische Flüsse, sowie für Methanausbeuten in der Biogasgemeinschaft vorhergesagt. Die prädizierten Bereiche waren dabei z. T. sehr groß und wenig aussagekräftig. Zudem ließen sich einige Analysemethoden, wie die Berechnung und Untersuchung von elementaren Flussvektoren (EFVs), nur für Modelle mit bis zu vier Organismen anwenden. Um diese Probleme zu lösen, wurde ein neuer Ansatz für reduzierte Gemeinschaftsmodelle entwickelt. Die Grundidee des RedCom-Ansatzes besteht in der Komprimierung der Einzelmodelle auf ausgewählte Nettoumsätze basierend auf den elementare Flussvektoren (EFVs) dieser Modelle. Als Selektionskriterium für die EFVs wurde minimaler Substratumsatz verwendet, um realistische Verhaltensweisen der einzelnen Organismen abzubilden. Die ausgewählten Lösungen dienten als Reaktionen im reduzierten Gemeinschaftsmodell. Letztere sind deutlich kleiner, prädizieren schmalerer Bereiche für Gemeinschaftskompositionen und ermöglichen eine Berechnung von EFVs auch bei Gemeinschaftsmodellen mit einer Größe von neun Organismen. Anhand eines linearisierten Drei-Organismen-Modells bestehend aus Desulfovibrio vulgaris, Methanospirillum hungatei und Methanosarcina barkeri wurden drei verschiedene Zielfunktionen für die Vorhersage relevanter Lösungen aus dem Lösungsraum getestet: Maximierung der Gemeinschaftswachstumsrate, Maximierung der Gesamtbiomasseausbeute sowie Maximierung der Biomasseausbeuten der einzelnen Organismen. Die Maximierung der Biomasseausbeuten aller Organismen schien dabei die realistischten Lösungen vorherzusagen. Desweiteren konnten sowohl im reduzierten als auch im linearisierten vollständigen Drei-Organismen-Modell Interventionsstrategien (z.B. Minimal Cut Sets) für erhöhte Methanausbeuten und Methanbildungsraten berechnet werden. Mit einem Sechs-Organismen-Modell, das zusätzlich Acetobacterium woodii, Syntrophobacter fumaroxidans und Propionibacterium freudenreichii enthielt und das Drei-Organismen-Modell um die Homoacetogense und die Ethanoloxidation über Propionat erweiterte, wurde der Einfluss verschiedener Ethanoloxidierer und des Erhaltungskoeffizienten untersucht. Ein Erhaltungskoeffizient von 1 mmolATP/gTM/h für alle Spezies spiegelte die experimentellen Daten am besten wider. Verschiedene Ethanoloxidierer resultierten bei gleichen Erhaltungskoeffizienten in ähnlichen Austauschraten und Ausbeuten. Experimentelle Daten einer Ethanolanreicherungskultur wurden sowohl vom bilinearen und linearisierten vollständigen als auch im reduzierten Modell gut wiedergegeben. In den vollständigen Modellen waren die vorhergesagten Bereiche für die spezifischen Raten jedoch sehr breit, wodurch diese Ergebnisse eine geringe Aussagekraft haben. Die in Metaproteomdaten gefundenen Taxonomien und Proteine ließen sich auf drei der sechs Organismen übertragen: D. vulgaris, M. hungatei und M. barkeri. Mit Hilfe dieser Informationen konnten die Modelle weiter reduziert und dadurch die Modellprädiktionen deutlich eingegrenzt werden. In einem letzten Schritt wurden die Gemeinschaftsmodelle um die Organismen Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum und Syntrophomonas wolfei erweitert. Für dieses Modell wurde Glukose als Substrat vorgegeben und Simulationsergebnisse mit experimentellen Daten einer Glukose-/Celluloseanreicherungskultur verglichen. Durch den neu entwickelten RedCom-Ansatz konnten Modelle von geringerer Größe erstellt werden, mit denen detaillierte Untersuchungen (z.B. EFV-Analyse) auch für größere Gemeinschaften möglich sind. Durch die Einbeziehung eines Optimalitätskriteriums ist der Lösungsraum dabei deutlich kleiner und schließt unrealistisches Verhalten (z.B. Substratverschwendung aus), wodurch die Ergebnisse eine höhere Aussagekraft haben. Die Modellierung von Biogasgemeinschaften unterschiedlicher Komplexität auf Basis des entwickelten Ansatzes lieferte Einsichten in die Interaktionen der verschiedenen Organismen und deren Produktionsverhalten bei der Biogasproduktion.

Microbial communities play an important role in geochemical cycles, human health and industrial applications. Different experimental and analytical methods including computer models have been employed to gain insights and a better understanding of the metabolic interactions between the species of the community and into the underlying principles. The focus of this thesis was on modeling of microbial consortia with stoichiometric metabolic models. One challenge here is the large number of microorganisms typically involved. As a result, community models are large in size and have a more complicated bilinear structure compared to linear single-species models. Anaerobic digestion, a stepwise degradation of organic polymers to biogas, served as an example of a complex microbial community in this thesis. In a first step, metabolic models of nine organisms representing key metabolic degradation steps (functions) in the biogas process were generated and validated. The single-species models were used to build a compartmented community model were each organism represents one compartment. It was assumed that all members of a stable community grow equally fast (balanced growth). The resulting full bilinear model was analyzed with nonlinear optimization and then linearized by fixing the community growth rate. Both models were used to predict community compositions, metabolic fluxes and yields. The simulations had a low predictive power and application of methods for detailed analysis (e.g. elementary flux vector analysis) was only feasible for small models of up to four organisms. In order to tackle these problems, a new approach called RedCom was developed. The main idea is to describe the single-species models with selected net conversions computed with the concept of elementary flux vectors (EFVs). EFVs were chosen for minimal substrate turnover and respective net conversions served as reactions to build a reduced community model. The reduced models were smaller in size and EFVs computation was possible for larger communities of nine organisms. Additionally, the predicted ranges of the simulations were greatly reduced and thus more concise. In order to find the most relevant solutions, three different objective functions were tested with a (linearized full) three-species community model consisting of D. vulgaris, M. hungatei and M. barkeri: Maximization of the community growth rate, maximization of the total biomass yield and maximization of the biomass yield of each organism. Maximization of the biomass yield of each organism appeared to be the most reasonable. Furthermore, the concept of minimal cut sets to find intervention strategies for improved production was applied to the linearized full and the reduced three-species model. Reasonable and interesting solutions were found in both models. Next, full and reduced models of a six-species community, additionally containing the organisms A. woodii, P. freudenreichii and S. fumaroxidans, were generated. These organisms extended the model for homoacetgenesis and propionate fermentation. The simulation results were compared with experimental data from an enrichment culture grown on ethanol. While both models reflected the experimental data well, the ranges for the specific exchange rates were significantly narrower in the reduced model leading to a higher predictive power. The reduced six-species model was used to investigate the influence of different ethanol oxidizers and the maintenance coefficients of the organisms. An equal maintenance coefficient of 1 mmolATP/gTM/h for all organisms reflected the experimental data best. Results were similar for different ethanol degraders (regarding exchange rates and methane yields) for equal maintenance coefficients. In addition to the abiotic data, metaproteomic data from the ethanol enrichment culture was used to further confine the model. The taxonomies from the culture could basically be mapped to three out of the six model organisms: D. vulgaris, M. hungatei and M. barkeri. Additional constraints for these findings led to a strongly confined solution space in the full and reduced model while still being close to the experimental data. Lastly, the model was extended for the organisms E. coli, C. acetobutylicum and S. wolfei allowing for an extended range of substrates for the community. Glucose was used as a substrate for this community and simulation results were compared with data of an enrichment culture grown on glucose/cellulose medium. In conclusion, the newly developed RedCom approach enables the construction of reduced community models with higher predictive power. The reduced models allow for the application of computationally more expensive methods such as EFV computation enabeling in turn a more detailed investigation of model properties. Modeling of biogas producing communities of different complexity with the newly developed approach led to new insights in the process. In particular the interactions of the different functional groups and their influence on the biogas production could be investigated in detail.