Intensified yellow fever and Zika virus production in animal cell culture

Abstract

Flaviviruses are transmitted to humans primarily by the bite of an infected mosquito. After infec-tion, the virus can cause severe disease patterns ranging from congenital malfunction to lethalhemorrhagic fever. The lack of specific treatments for flavivirus-related diseases turns vaccinationto the only preventive countermeasure. An effective vaccine was already developed against yellowfever virus (YFV) being considered as the prototypic flavivirus. Until now, the vaccine is stillmanufactured in embryonated chicken eggs using traditional production methods. However, pro-duction capacities are difficult to expand at low profit margins, leading to a chronic undersupplyof the vaccine. New production processes are required that can be ideally transferred to newlyemerging and re-emerging flaviviruses such as Zika virus (ZIKV).This work aimed to develop a next-generation, cell culture-based YFV vaccine productionprocess. Of particular interest was the fast and efficient virus production with perfusion bioreactorsystems as well as transferability to manufacturing of other flaviviruses such as wild-type ZIKV whichreplicates only at low cell-specific titers.In the first two parts of this work, YFV propagation in different cell substrates was investi-gated.Initial infection experiments with adherent Vero cells, which are regarded as a typical referencefor flavivirus replication, revealed cell-specific virus yields of about 10 infectious virions per cell(PFU/cell). To overcome anchorage-dependent scale-up limitations for large-scale production, various suspension cells were infected. Thereby, BHK-21SUS and EB66® cells demonstrated highestviral permissiveness. Sequential virus adaptation to EB66® cells resulted in maximum cell-specificvirus titers similar to Vero cells. However, due to slow virus spreading in the cell population, eithermultiplicity of infection (MOI) had to be increased or infection periods had to be extended beyondtypical batch infection conditions. This enabled the infection of the entire cell population leadingto increased viral titers. Finally, semi-continuous two-stage cultiva-tions were performed. They indicated the absence of replication-interfering non-infectious virus particles, which could have otherwise disturbed the production process in perfusion mode. In the third and fourth part, YFV production in batch cultivation was transferred to a perfusionprocess. First infection experiments with BHK-21SUS cells in pseudo-perfusion mode enabled highcell concentrations of 5.9×107 cells/mL and similar cell-specific virus yields compared to batchinfections (7–11 PFU/cell). The production process was then transferred to 1 L bioreactors coupledto scalable membrane-based perfusion units such as the tangential flow filtration (TFF) and thealternating tangential flow filtration (ATF) system. The fast growing EB66® cell line reached9.5×107 cells/mL in perfusion mode applying the ATF system. Virus titers of7.3×108 PFU/mL were achieved in less than two weeks. The total amount of virus in a 700 mL bioreactor would have beensufficient to deliver raw material for almost 107 doses of live-at-tenuated YFV vaccine. Subsequently, the process was transferred to ZIKV production. For this purpose, various Brazilian ZIKV isolates were tested and the high-yield ZIKVRJ isolate was identified. Cell-specific virus yieldscould be further increased from 0.5 to 5.5 PFU/cell by se-quential virus adaptation to the EB66®cells. For the subsequent ATF perfusion process, an online biomass probe for perfusion rate controlwas used. This minimized manual intervention and in-creased the batch-to-batch reproducibility. Alarge-volume cryo-bag was utilized for direct bioreactor inoculation, providing additional production flexibility. This process enabled very high cell concentrations (1.6×108 cells/mL) and ZIKV titers(1.0×1010 PFU/mL). To this end, volu-metric productivities of the intensified perfusion process(8.1×1010 PFU/L/day) even exceeded the batch culture (1.7×1010 PFU/L/day) previously considered the most efficient production mode.The fifth part of this thesis covered the use of online multi-frequency capacitance probes toestimate cell growth during perfusion operation and virus infection. Three mathematicalmodels were used to describe viable cell concentration and viable cell volume. The first-orderlinear regression model correlated permittivity signals with offline cell count data and allowed anaccu-rate estimation of cell concentrations. However, the correlation parameter had to be slightlyad-justed for each cultivation. The same accuracy was observed for partial least squares regressionmodels with multivariate data analysis of spectroscopic frequency data. The best approximationwas obtained by using the Cole-Cole equation to calculate the cell volume. Subsequently, addi-tional raw data from the online probe were evaluated to detect virus-induced changes in the celland to deduce virus dynamics. No dielectric signal or parameter could be assigned to virus repli-cation. Instead, the capacitance probe could be reliably used for cell growth monitoring throughoutthe infection phase. Only during the cell decline phase, discrepancies between offline determinedand online estimated cell concentrations occurred.In the last part of this work, different hollow fiber membranes were systematically evaluatedwith regard to filter fouling and membrane permeability in order to allow for direct virus harvest-ing. Eight membranes of five different materials (cut-offs between 0.08 μm and 1.68 μm) werecharacterized. Measurements of the zeta potential suggested a principle repulsion between col-loides (e.g. cells, particles) of the culture broth and the membranes. Subsequently, mem-braneroughness, surface structure and porosity were characterized using scanning electron mi-croscopy.Polysulfone (PS) membranes were identified with best fouling properties (smooth surface structures and high porosity) for highest permeate volumes. This was confirmed in fil-tration experiments with YFV-infected BHK-21SUS cells in cross-flow filtration mode. A large-pored 0.34 μmPS membrane was particularly suitable for direct virus harvest over an extended time period. Asmall-pored 0.08 μm PS membrane, on the other hand, retained virions almost completely in thebioreactor system, but also accumulated DNA and protein impurities.Overall, important aspects of process intensification were elaborated. The presented perfusionprocess yielded in very high YFV titers and was successfully transferred to the production ofZIKV. In general, it is a well-suited platform for process development and intensification in vac-cine manufacturing, particularly for viruses that replicate only at low cell-specific virus yields.

Flaviviren werden primär durch den Biss einer infizierten Mücke auf den Menschen übertragen. Nach Infektion kann das Virus schwere Krankheitsbilder verursachen, die von angeborenen Fehl-funktionen bis hin zu tödlichem hämorrhagischem Fieber reichen. Da es keine gezielten Behand-lungen für flavivirusbedingte Krankheiten gibt, ist die Impfung die einzige präventive Gegenmaß-nahme. Ein wirksamer Impfstoff gegen das Gelbfiebervirus (YFV), das als prototypisches Flavi-virus gilt, wurde bereits entwickelt. Bislang wird dieser Impfstoff noch in bebrüteten Hühnereiern nach traditionellen Produktionsmethoden hergestellt. Jedoch lassen sich die Produktionskapazitä-ten nur schwer erweitern und durch die geringe Gewinnmarge kommt es immer wieder zu Lie-ferengpässen des Impfstoffs. Neue Produktionsverfahren werden benötigt, die sich idealerweise auf neue und wieder aufkommende Flaviviren übertragen lassen. Ein Beispiel dafür ist das Zika-Virus (ZIKV), welches sich nur bei niedrigen zellspezifischen Ausbeuten vermehren lässt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines zellkulturbasierten YFV-Impfstoffproduktions-prozesses. Der Schwerpunkt lag dabei auf einer schnellen und effizienten Virusproduktion mit Perfusionsbioreaktorsystemen, die sich auch auf andere Flaviviren, wie beispielweise dem Wild-typ-ZIKV, anwenden ließ. In den ersten beiden Teilen dieser Arbeit wurde die YFV-Vermehrung in verschiedenen Zell-substraten untersucht. Erste Infektionsexperimente mit adhärenten Vero-Zellen, die als typische Referenz für Flavivirusvermehrung gelten, zeigten zellspezifische Virusausbeuten von etwa 10 in-fektiösen Viruspartikeln pro Zelle (PFU/Zelle). Um den Transfer in den Produktionsmaßstab zu erleichtern, wurden nun Suspensionzellen infiziert. Dabei zeichneten sich BHK-21SUS and EB66®-Zellen durch eine hohe virale Permissivität aus. Die sequentielle Virusadaption an EB66®-Zellen führte zu maximalen zellspezifischen Virustitern ähnlich den der Vero-Zellen. Bedingt durch die langsame Ausbreitung des Virus in der Zellpopulation, musste jedoch entweder die Multiplizität der Infektion (MOI) erhöht oder Infektionsperioden über typische Batch-Infektionsprozesse hinaus verlängert werden. Beide Maßnahmen ermöglichten die Infektion der gesamten Zellpopulation, die zur Steigerung der Virusausbeute führte. Schließlich wurden semi-kontinuierliche, zweistufige Kultivierungen durchgeführt. Dabei wurden keine replikationsinterferierende, nicht-infektiöse Vi-ruspartikel nachgewiesen, da diese andernfalls den Produktionsprozess in Perfusion hätten stören könnten. Im dritten und vierten Teil wurde die YFV-Herstellung von einem Batch-Prozess zu einem Perfusionsprozess weiterentwickelt. Erste Infektionsexperimente mit BHK-21SUS-Zellen in Pseudo-Perfusion ermöglichten hohe Zellkonzentrationen von 5,9×107 Zellen/mL und ähnliche zellspezifische Virusausbeuten im Vergleich zu Batch-Infektionen (7–11 PFU/Zelle). Der Produk-tionsprozess wurde anschließend auf 1 L-Bioreaktoren übertragen, die an skalierbare, membran-basierte Perfusionseinheiten wie dem Tangentialflussfiltrations- (TFF) oder alternierenden Tan-gentialflussfiltrationssystem (ATF) gekoppelt wurden. Die schnell wachsende EB66®-Zelllinie erreichte 9,5×107 Zellen/mL in dem ATF-System. Dabei wurden Viruskonzentrationen von 7,3×108 PFU/mL in weniger als zwei Wochen erreicht. Diese Virusmenge wäre ausreichend ge-wesen, um unaufgereinigtes Material für nahezu 107 YFV-Impfstoffdosen eines Lebendimpftstoffs bereitzustellen. Im Anschluss wurde der Prozess auf die ZIKV-Produktion übertragen. Dafür wur-den zunächst verschiedene brasilianische ZIKV-Isolate getestet. Die höchsten Ausbeuten wurden mit dem ZIKVRJ Virusisolat erreicht. Die zellspezifischen Ausbeuten konnten durch die sequenti-elle Virusadaption an EB66®-Zellen von 0,5 auf 5,5 PFU/Zelle weiter erhöht werden. Für den fol-genden Perfusionprozess wurde eine Online-Biomassesonde zur Perfusionsratenkontrolle instal-liert. Dadurch wurden manuelle Eingriffe minimiert und die Reproduzierbarkeit der Kultivierun-gen erhöht. Zur direkten Beimpfung des Bioreaktors wurde ein großvolumiger Kryobeutel ver-wendet, wodurch zusätzliche Produktionsflexibilität erreicht wurde. Dieser Prozess ermöglichte extrem hohe Zell-Konzentrationen (1,6×108 Zellen/mL) und ZIKV-Titer (1,0×1010 PFU/mL). Da-bei übertrafen die volumetrischen Produktivitäten des intensivierten Perfusionsprozesses (8,1×1010 PFU/L/Tag) sogar die bisher als effizientester Produktionsmodus geltende Batchkultur (1,7×1010 PFU/L/Tag). Der fünfte Teil dieser Arbeit behandelte den Einsatz von Online-Multifrequenzkapazitätsson-den zur Abschätzung der Biomassezunahme während des Perfusionsbetriebs und der Virusinfek-tion. Dafür wurden drei mathematische Modelle zur Beschreibung der lebensfähigen Zellkonzent-ration und des lebensfähigen Zellvolumens untersucht. Das lineare Regressionsmodell erster Ord-nung korrelierte Permittivität mit Offline-Daten und erlaubte eine genaue Abschätzung der Zell-konzentrationen. Jedoch mussten die Korrelationsparameter für jede Kultivierung geringfügig an-gepasst werden. Eine ähnliche Präzision wurde für das PLS-Regressionsmodell (partial least squares regression) und multivariater Datenanalyse der spektroskopischen Frequenzdaten beo-bachtet. Die beste Annäherung wurde durch die Verwendung der Cole-Cole-Gleichung zur Be-rechnung des Zellvolumens erzielt. Anschließend wurden zusätzliche Rohdaten der Online-Sonde ausgewertet, um virusbedingte Veränderungen in der Zelle zu erkennen und daraus auf die Vi-rusdynamik zu schließen. Jedoch konnte kein dielektrisches Signal oder Parameter der Virusver-mehrung zugeordnet werden. Stattdessen ließ sich die Kapazitätssonde aber zuverlässig über die gesamte Infektionsphase zur Biomasseaufzeichnung verwenden. Lediglich während der Absterbe-phase traten Diskrepanzen zwischen offline-bestimmten und online-geschätzten Zellkonzentratio-nen auf. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden verschiedene Hohlfasermembranen hinsichtlich Fouling und Membranpermeabilität zur direkten Virusernte systematisch bewertet. Acht Membranen aus fünf verschiedenen Materialien (Ausschlussgrößen zwischen 0,08 μm und 1,68 μm) wurden cha-rakterisiert. Messungen des Zeta-Potenzials deuteten auf eine prinzipielle Abstoßung zwischen den Zellen und Partikeln in der Kulturbrühe mit den Membranen hin. Im Anschluss wurden mit Hilfe eines Rasterelektronenmikroskops die Membranrauhigkeit, Oberflächenstruktur und Porosität cha-rakterisiert. Dabei fielen die Polysulfon-Membranen positiv auf, die aufgrund glatter Oberflächen-strukturen und hoher Porosität für hohe Permeatvolumen geeignet wären. In anschließenden Tan-gentialflussfiltrationsversuchen mit YFV-infizierten BHK-21SUS Zellen wurde diese Vermutung bestätigt. Eine großporige 0,34 μm Polysulfon-Membran eignete sich besonders zur direkten Vi-rusernte über einen längeren Zeitraum. Eine kleinporige 0,08 μm PS-Membran hingegen konzentrierte Viruspartikel vollständig im Bioreaktorsystem, wobei sich jedoch auch DNA- und Proteinverunreinigungen ansammelten. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige Aspekte der Prozessintensivierung erar-beitet. Der entwickelte Perfusionsprozess ermöglichte sehr hohe Titer von YFV und wurde erfolg-reich auf die Produktion von ZIKV übertragen. Generell können die durchgeführten Studien als Basis für die Prozessentwicklung und -intensivierung in der Impfstoffherstellung dienen, insbesondere für Viren, die sich nur bei geringen zellspezifischen Virusausbeuten vermehren lassen.