ARHGEF6 controls speed and directionality of lymphocyte migration by regulating Rac1PAK2/LIMK1/cofilion signaling pathway

Abstract

RhoGEF proteins are multi-domain activators of Rho GTPases that mediate signaling from cell surface receptors to the cytoskeleton, thereby regulating variety of cellular processes including cell migration. The PIX family of RhoGEFs, ARHGEF6 and ARHGEF7, constitutively associate with the GIT family of ArfGAPs (GIT1 and GIT2) and together these four proteins form a core complex (PIX/GIT complex) that interacts with other proteins composing a large, multiprotein assembly. ARHGEF6 is an activator of Rho GTPases and its expression is restricted to few cell types including immune cells. In contrast, ARHGEF7 has a much broader expression and its deletion is lethal. Our group generated Arhgef6−/− mice, which are viable but showed impaired thymocyte development and altered migratory behaviour of both thymocytes and T cells. Namely, Arhgef6 deletion results in cells that show increased chemokinesis and chemotaxis, which is a relatively rare phenotype. The aim of the present study was to decipher which signaling pathways are affected by loss of ARHGEF6. We corroborated that activated CD4+ T cells from Arhgef6−/− mice migrate significantly faster than wild-type cells, and in addition, showed ‘twist-and-turn’ migration pattern characterized by frequent changing the direction thus resulting in reduced directionality. We identified several molecular mechanisms underlying this phenotype. Arhgef6−/− T cells exhibited increased ARHGEF7 level and consequently increased Rac1 activity, suggesting that, at least in some cellular aspects, ARHGEF7 may compensate for ARHGEF6 deficiency. However, although ARHGEF7 interacts with PAK2, the activity of PAK2 was greatly reduced indicating indispensable presence of ARHGEF6 for its function. Compromised PAK2 activity altered the activity of its downstream kinase, LIMK1, which resulted in over-activation of cofilin, leading to increased actin turnover and abnormal lamellipodia morphology. Due to ARHGEF6 deficiency, the level of ARHGEF6 binding partner GIT2 was reduced and GIT1/2-associated protein, paxillin, was mislocalized. Paxillin, together with another FA protein, vinculin, plays important role in formation and maturation of focal contacts. Their reduction in Arhgef6−/− CD4+ T cells may result in reduced anchoring and adhesion of these cells. Taken together, obtained data suggest an important role of ARHGEF6 in regulating directional migration of lymphocytes.

RhoGEFs sind Multidomänen-Proteine, die als Aktivatoren von RhoGTPasen Signalwege zwischen Zelloberflächenrezeptoren und dem Cytoskelett steuern. Auf diese Weise regulieren RhoGEFs neben einer Vielzahl anderer zellulärer Prozesse auch die Zellmigration. RhoGEFs der PIX-Proteinfamilie, ARHGEF6 und ARHGEF7, regulieren die Aktivität der kleinen RhoGTPasen Rac und Cdc42. Beide PIX-Proteine sind konstitutiv mit den ArfGAP-Proteinen GIT1 und GIT2 assoziiert. Diese vier Proteine bilden zusammen einen zentralen Proteinkomplex, den sogenannten PIX/GIT-Komplex, der sich durch Bindung weiterer Proteine zu sehr großen Multiproteinaggregaten formieren kann. Während ARHGEF7 in vielen Geweben exprimiert wird und das Fehlen dieses Proteins embryonal letal ist, ist die Expression von ARHGEF6 auf wenige Zelltypen, insbesondere Immunzellen, beschränkt. Unsere Arbeitsgruppe hat Arhgef6−/− Mäuse hergestellt, die lebensfähig sind, jedoch ein verändertes Migrationsverhalten von Lymphozyten und eine gestörte Thymozytenentwicklung aufweisen. Überraschenderweise führte die Deletion von Arhgef6 in den untersuchten Zellen zu einer generell erhöhten Motilität mit verstärkter Chemokinese und Chemotaxis. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Beschreibung ARHGEF6-regulierter Signalwege in T-Zellen. Wir konnten zeigen, dass CD4+ T-Zellen von Arhgef6−/− Mäusen schneller migrieren, dabei aber nicht so wie wildtypische Zellen die Migrationsrichtung aufrechterhalten konnten. Wir identifizierten folgende Mechanismen, die diesen Phänotype erklären: Arhgef6−/− T-Zellen zeigten (i) verstärkte ARHGEF7 Expression, die folgerichtig auch mit einer stärkeren Aktivität von Rac1 assoziiert war. ARHGEF7 kann daher vermutlich den Verlust von ARHGEF6 teilweise kompensieren. Obwohl jedoch ARHGEF7 mit PAK2 interagieren kann, war (ii) die Aktivität dieser Kinase in Abwesenheit von ARHGEF6 stark reduziert, was die Bedeutung von ARHGEF6 für die Aktivierung von PAK2 unterstreicht. Als direkte Folge der gestörten PAK2 Aktivität war auch die Aktivität der PAK2-Zielkinase LIMK1 reduziert. Dies führte durch Überaktivierung des Aktin-Depolymerisierungsfaktors Cofilin zu einem gesteigerten Umbau von Aktin und, als Folge davon, zu einer unregelmäßigen Morphologie der Lamellipodien migrierender Zellen. Aufgrund der ARHGEF6-Defizienz war (iii) auch die Proteinkonzentration des Bindungspartners GIT2 reduziert. Zusätzlich beobachteten wir eine veränderte Lokalisation des GIT1/2-assoziierten fokalen Adhäsionsprotein Paxillin, sowie von Vinculin, das ebenfalls an der Bildung und Reifung fokaler Zellkontakte beteiligt ist. Diese Veränderungen in Arhgef6−/− CD4+ T-Zellen könnten möglicherweise zu einer schwächeren Zell-Verankerung und Adhäsion beitragen. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass ARHGEF6 eine wichtige Rolle in der gerichteten Migration von Lymphozyten spielt.