Charakterisierung der Influenzavirus-Vermehrung in genetisch veränderten humanen Zelllinien zur Optimierung der Impfstoffproduktion

Abstract

Die Zellkultur-basierte Influenza-Impfstoffproduktion stellt eine vielversprechende Alternative sowohl zu klassischen Ei-basierten Produktionsverfahren als auch zur Produktion von rekombinanten Influenzavirus-Proteinen in Insektenzellen dar und wird seit mehreren Jahren mithilfe von MDCK- und Vero-Zellen erfolgreich durchgeführt. Um die Vielfalt möglicher Produktionssysteme zu erweitern und um eine optimale Immunogenität der erzeugten Impfstoffe zu gewährleisten, gewinnen humane Produktionszelllinien wie beispielsweise PER.C6-, CAP-, HEK293- und AGE1.HN-Zellen ebenfalls an Bedeutung. Bei der Verwendung humaner Zelllinien ist jedoch zu beachten, dass diese eine stark ausgeprägte antivirale Immunantwort gegenüber Influenzavirus-Infektionen ausbilden, welche die Virusproduktion einschränken können. Des weiteren scheint die Virusproduktion durch zelluläre Schlüsselfaktoren limitiert zu sein, da wesentlich weniger Viren freigesetzt werden als intrazelluläre Ressourcen zur Verfügung stehen. Anhaltspunkte hierfür lieferten bereits Studien zu Wirtzellfaktoren, in denen durch den Knockdown, wie beispielsweise des Interferon-α/β-Rezeptors (Zelloberflächenrezeptor zur Bindung von Typ-I-Interferonen), bzw. durch die Überexpression, wie beispielsweise der α-2,6-Sialyltransferase (katalysiert den Transfer von Sialinsäuren von CMP-Sialinsäuren auf Galaktose-enthaltende Substrate, ermöglicht die Umwandlung von α-2,3- Sialinsäuren zu α-2,6- Sialinsäuren), die Virustiter gesteigert werden konnten. Der erste Teil dieser Dissertation befasste sich daher mit der Fragestellung, ob die antivirale Immunantwort die Virusproduktion in humanen Produktionszelllinien sowie in Modellzelllinien limitiert. Als Produktionszelllinien kamen die humanen Zelllinien AGE1.HN (ProBioGen AG) und HEK293SF zum Einsatz, welche bereits erfolgreich für die Vermehrung von Influenzaviren getestet wurden. Als Modellzelllinien dienten A549- und HEK293-Zellen, welche sehr häufig für die Influenzavirus-Grundlagenforschung verwendet werden. Zunächst erfolgten Untersuchungen der antiviralen Immunantwort durch die Stimulation mit Interferon-β (einem Aktivator der antiviralen Immunantwort) sowie Infektionsversuche mit Influenzavirus A/PR/8/34 und einem deletierten Virusstamm, Influenzavirus delNS1, in Kombination mit Interferon-β-Stimulationen von HEK293-, HEK293SF-, AGE1.HN- und A549-Zellen. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede bei der Aktivierung der antiviralen MxA-Genexpression (Interferon-induzierte GTPase zur Abwehr von Virusinfektionen) sowie bei den erzielten Virustitern. So konnte weder nach einer direkten IFN-Stimulation noch im Rahmen einer Virusinfektion für die Zelllinien HEK293, HEK293SF und AGE1.HN eine Steigerung der antiviralen MxA-Genexpression beobachtet werden. Im Vergleich dazu zeigten A549-Zellen einen deutlichen Anstieg des MxA-Genexpressionslevels unter beiden Bedingungen. Des weiteren kam es durch die Aktivierung der antiviralen Immunantwort zu einer Verzögerung der Virusproduktion (Gesamtvirustiter) bei den A549-Zellen. Anschließende Literaturrecherchen ergaben, dass es sich bei den verwendeten Produktionszelllinien (HEK293, HEK293SF und AGE1.HN) um adenoviral-transformierte Zelllinien handelt, welche u. a. die adenoviralen Gene E1A und E1B für die Zellimmortalisierung exprimieren. Im Gegensatz dazu erreichten A549-Zellen durch natürliche Mutationen ihren immortalisierten Zustand. Nachfolgende E1A- und E1B-Knockdownstudien mit HEK293- und AGE1.HN-Zellen zeigten deutlich, dass durch den Knockdown von E1A die MxA-Genexpression über die Stimulation mit Interferon-β gesteigert werden konnte. Infektionsversuche mit Interferon-sensitiven Virusstämmen (Vesicular-Stomatitis-Virus, Influenzavirus delNS1) zeigten zudem, dass sich diese adenoviral-transformierten Zelllinien aufgrund ihrer unterdrückten antiviralen Immunantwort gut für die Vermehrung von Interferon-sensitiven Viren eignen. Der zweite Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Fragestellung, ob durch eine gezielte Überexpression bzw. einen short hairpin RNA-vermittelten Knockdown von ausgewählten Wirtszellfaktoren die Virusvermehrung gesteigert werden kann. Die Auswahl der Genkandidaten basierte dabei auf den Ergebnissen eines genomweiten RNAi-Screens. Für die Erzeugung der Überexpressions- und Knockdownzelllinien mittels lentiviraler Transduktion wurde die A549-Modellzelllinie verwendet, welche in dem oben genannten RNAi-Screen zum Einsatz kam. Der Hauptfokus dieser Arbeit lag auf der Steigerung des Gesamtvirustiters. Leider konnte dieser durch keine der getesteten Überexpressions- und Knockdownzelllinien erreicht werden. Darauffolgende Studien der frühen Replikationssphase zeigten jedoch für einige Zelllinien Unterschiede in der Virusproduktionsdynamik. Basierend auf diesen Erkenntnissen erfolgte die Herstellung von Zelllinien mit mehreren Genüberexpressionen („Kombinationszelllinien“), wodurch die frühen Gesamtvirustiter weiter gesteigert werden konnten. Weiterführende molekularbiologische Analysen anhand von fünf Überexpressionszelllinien erlaubten anschließend die Aufstellung von Theorien über den Einfluss der untersuchten Genkandidaten auf die Influenzavirus-Replikation. Dabei erfolgte die Untersuchung des nukleären viralen Ribonukleoprotein-Komplex (vRNP)-Imports und vRNP-Exports mittels bildgebender Durchflusszytometrie, die Analyse der viralen RNA-Synthese mittels quantitativer reverser Transkription real-time PCR und die Bestimmung des viralen M1-, PA- und NP-Proteinlevels durch Western Blot-Analysen, wobei zum Teil deutliche Unterschiede zu den Kontrollzelllinien (parentale A549-Zelllinie und Überexpressions-Kontrollzelllinie) beobachtet werden konnten. Neben diesen Untersuchungen erfolgte die Generierung und Untersuchung von Einzelzell-basierten Zellpopulationen. Mithilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass keine Korrelation zwischen einer starken Genüberexpression und gesteigerten frühen Gesamtvirustitern für die untersuchten Zelllinien bestand. Eine anschließende Validierung der Ergebnisse in der humanen Produktionszelllinie AGE1.HN war geplant, konnte jedoch aus Zeitgründen nicht mehr umgesetzt werden. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Dissertation gezeigt werden, dass (1) die Influenza-Impfstoffproduktion in den derzeitig zur Verfügung stehenden adenoviral-transformierten, humanen Produktionszelllinien nicht durch die antivirale Immunantwort beeinträchtig wird und (2), dass durch die Veränderung der Genexpression von Wirtszellfaktoren, v. a. durch eine gezielte Genkombination, ein früherer Anstieg der Virustiter erzielt werden kann, ein Steigerung des finalen Gesamtvirustiters jedoch nicht möglich ist.

Influenza vaccine production using cell-based systems has become an attractive alternative to well-established egg-based manufacturing as well as to the production of recombinant influenza virus proteins in insect cells due to advantages in scalability and flexibility in process scheduling. However, only two animal cell lines (Vero and MDCK) are currently approved and used for influenza vaccine production. To broaden the field of suitable production cell lines and to improve immunogenicity of influenza vaccines, human-derived production cell lines such as PER.C6-, CAP-, HEK293- and AGE1.HN cells are gaining importance. However, human cells are able to establish a strong antiviral immune response which might limit influenza virus production. In addition, influenza virus replication seems to be restricted by specific cellular bottlenecks while intracellular resources for precursors appear to be abundant. Evidence for this has already been provided by several studies where virus titres could be increased by either knockdown or overexpression of selected host cell factors, for example interferon-α/β receptor (cell surface receptor for type I interferon binding) and α-2,6-sialyltransferase (catalyses the transfer of sialic acid from CMP-sialic acid to galactose-containing substrates, turns α-2,3-linked sialic acids to α-2,6-linked sialic acids), respectively. Therefore, the first part of this thesis addressed the question whether the antiviral immune response limits virus production in human production cell lines or other model cell lines. For this, we used the human production cell lines AGE1.HN (ProBioGen AG) and HEK293SF, which have already been successfully tested for the production of influenza viruses. Model cell lines were A549 and HEK293 cells, which are used frequently for basic influenza virus research. To investigate the influence of the antiviral immune response, HEK293, HEK293SF, AGE1.HN, and A549 cells were either stimulated with interferon-β (activator of antiviral immune response) or stimulated in combination with an influenza virus A/PR/8/34 or an influenza deletion strain (influenza virus delNS1) infection. Interestingly, for HEK293, HEK293SF and AGE1.HN only low MxA gene expression levels were detected in both experiments, whereas A549 cells established a much stronger antiviral response. In addition, virus production was delayed in interferon-β stimulated A549 cells. Subsequent literature research suggested a potential impact of adenoviral E1A and E1B protein expression on the antiviral immune response. In contrast to A549 cells, which spontaneously transformed by gene mutations, HEK293, HEK293SF and AGE1.HN cells were immortalized by adenoviral transformation and thereby express adenoviral protein E1A and E1B. Knockdown studies of E1A in HEK293 and AGE1.HN cells demonstrated a partial restoration of MxA gene expression. In addition, vesicular stomatitis virus and influenza virus delNS1 infection studies showed that these adenoviral transformed cell lines support replication of interferon sensitive viruses due to their impaired antiviral immune response. The second part of this thesis addressed the question whether virus production can be increased by targeted overexpression or short hairpin RNA (shRNA)-mediated knockdown approaches of selected host cell factors. Selection of gene candidates was based on the results of a genome-wide RNAi screen performed in A549 cells. Production of overexpression and knockdown cell lines was performed by lentiviral transduction. First, the final concentration of virions (total virus titre) was analysed. However, none of the tested overexpression and knockdown cell lines displayed increased titres. Though, subsequent studies showed differences in early virus production or some cell lines. Based on these findings, cell lines with several gene overexpressions were produced, which further increased early total virus titres. To gain deeper insights in the biological background of these effects, different steps of influenza virus replication were analysed using imaging flow cytometry (vRNP nuclear import and export studies), quantitative reverse transcription real-time PCR (quantification of v/c/mRNA level of segment 5) and western blot analysis (determination of M1, PA and NP protein level). Thereby, clear differences of some overexpression cell lines compared to control cell lines (parental A549 cell line and overexpression control cell line) could be observed. In addition to these investigations, single cell-based cell populations were generated to analyse possible correlations between strong gene overexpression and increased early HA titres. However, this could not be confirmed. A subsequent validation of the results in AGE1.HN cells was planned but could not be implemented due to time constraints. In summary, this thesis showed that (1) influenza vaccine production is not impaired by the antiviral immune response in currently available adenoviral-transformed human production cell lines and (2) that by altering gene expression of host cell factors, in particular by targeted gene combinations, early virus release can be achieved but an increase in final total virus titres was not possible.