Determining targeting specificity of nuclearly encoded organelle proteins

Abstract

Pflanzenzellen tragen zwei Organellen endosymbiotischen Ursprungs, Mitochondrien und Chloroplasten (Plastiden). Die meisten ihrer Proteine sind im Zellkern codiert und müssen deshalb nach ihrer Synthese im Cytosol in das jeweilige Zielorganell "zurück"transportiert werden. In der Regel erfolgt dieser Transport monospezifisch, d.h. nur in eines dieser Organellen. Allerdings konnten in den letzten Jahren einige Proteine identifiziert werden, die "mehrdeutige" Transitpeptide für den Transport sowohl in die Mitochondrien als auch in die Plastiden tragen. Ein solches dual targeting ist jedoch häufig umstritten, zum einen wegen der oftmals unklaren Funktion des Proteins in einem der Organellen, zum anderen wegen divergenter Ergebnisse bei Verwendung mehrerer experimenteller Ansätze. Deshalb sollten in dieser Arbeit vier häufig genutzte in vivo-Ansätze zur subzellulären Proteinlokalisierung systematisch miteinander verglichen werden. Außerdem wurde hier erstmals eine in vivo-Methode auf Pflanzenzellen angewendet, die auf spontan assemblierenden Teilen eines Fluoreszenzproteins (self assembling split-FP) beruht.

The uniqueness of plant cells is marked by the presence of two organelles of endosymbiotic origin, namely mitochondria and plastids. Most of the organelle proteins are encoded in the nucleus, synthesized in the cytosol and need to be “re”-transported into the respective target organelle. While transport is in most instances strictly monospecific, a group of proteins carries “ambiguous” transit peptides mediating transport into both, mitochondria and plastids (dual targeting). A number of different approaches including in organello and in vivo assays are established to determine the targeting specificity of such transit peptides. Due to variability in the results obtained from different experimental approaches, such dual targeting is often disputed particularly in those instances where the function of these proteins is enigmatic in one or the other organelle. In this work, four in vivo approaches based on fluorescent protein (FP) tagging were systematically analyzed. Furthermore, a novel self-assembling splitfluorescent protein-based approach was established to circumvent some of the inherent drawbacks of the ‘standard’ FP-based approaches.