Of proteins and lipids : a molecular dynamics study of membrane-bound Rab5

Abstract

Cellular trafficking involves spatially distinct organelles which are related by a sophisticated vesicular transport system. Vesicles from the plasma membrane are transported to early endosomes, which serve as sorting stations directing cargo either to the trans-Golgi network, to be degradaded via late endosomes and lysosomes, or back to the plasma membrane for recycling. The membrane-bound small GTPase Rab5 is the master regulator of endocytic cargo transport, and controls, amongst others, vesicular transport between the plasma membrane and the early endosome, early endosome fusion and events in phagocytosis. Due to its prominent role in endocytosis, Rab5 decides about the fate of internalized cargo including cell surface signaling receptors, and is thus indirectly involved in a variety of infectious diseases, neuronal disorders and cancer. As a small GTPase, Rab5 consists of a structurally conserved catalytic GTPase (G) domain, which is able to bind guanosine di- or triphosphate (GDP/GTP) and to hydrolyze GTP with a slow intrinsic rate. Rab5 serves as a molecular switch shuttling between an inactive, GDP-bound and an active, GTP-bound state, the latter recruiting effector proteins to the membrane. The G domain is connected to the membrane via a long C-terminal hypervariable region (HVR). Two covalently attached geranylgeranyl chains at the Rab5 extreme C-terminus enable bilayer anchorage. While Rab5(GTP) is solely membrane-localized, Rab5(GDP) shuttles between the bilayer surface and the cytoplasm in a RabGDI (GDI)-dependent manner. Until today, Rab5 crystal structures contain only G domain residues and are missing the flexible protein N- and C-termini. The geranylgeranyl post-translational modification represents another challenge with regard to protein synthesis for Rab5 investigation by wet lab experiments. These issues render preparation and experimental analysis of Rab5 extremely labor-intensive, costly and timeconsuming. Facing these experimental challenges, Rab5 characterization by computational studies represents a promising alternative strategy. A comparative modeling approach combined with molecular dynamics simulations was used in this thesis to obtain full-length Rab5(GDP) and Rab5(GTP) structures and to investigate their dynamics and interactions with membranes and protein binding partners. In the complex charged membrane, but not in the uncharged model bilayers, the monomeric Rab5 G domain tilted toward the bilayer surface in a nucleotide-specific manner. The switch regions, which are essential for binding partner recognition, predominately adapted a buried conformation in the GDP-bound state. The GTP-bound state was mainly associated with fully accessible switch regions on the protein side distal to the membrane. The tilting of the G domain is a necessary prerequisite which enables the small GTPase to recruit and bind effectors in very close proximity to the membrane. The G domain re-orientation was found to be mainly driven by long-range electrostatic interactions between basic residues of the HVR and the negatively charged PI(3)P signaling lipid in the early endosome membrane. These interactions were shown to slow down the peptide lateral diffusion and increased the Gibbs free energy associated with the bilayer-to-water transfer of the membrane anchor. Long-term coarsegrained simulations revealed an active recruitment of PI(3)P to the HVR, which serves the formation of spatially distinct Rab5- and PI(3)P-enriched signaling platforms. The capability of Rab5 to form dimers is controversially debated in literature. Here, dimerization of membrane-bound Rab5 into low-affinity complexes was observed via distinct dimerization interfaces in both nucleotide states. In case of Rab5(GDP), dimerization occurred preferentially via the switch I -interface, leaving the switch II region largely accessible. In contrast, helical interfaces of the switch II region contributed predominately to dimerization of Rab5(GTP). Based on the protein surface areas involved in dimerization, GDP-bound Rab5 dimers were more stable compared to Rab5(GTP) dimers. Rab5(GDP) dimerization at high protein concentrations may serve to generate a membrane-associated pool of immediately available Rab5(GDP) independent of GDI binding. In Rab5(GTP) dimers, at least one monomer exhibited an improved switch region accessibility compared to monomeric Rab5 due to a more exposed position farther from the membrane surface. The preference of both Rab5 activation states for different dimerization sites reflects their participation in specific protein-protein interactions. Residues in the switch regions essential for effector recognition were mainly accessible in Rab5(GTP) dimers. GDI is a major binding partner of Rab5(GDP) and was shown to interact with the small GTPase primarily via switch II residues that are hardly involved in dimerization. GDI releases Rab5(GDP) from the bilayer into the cytoplasm, keeps it soluble by accommodating the hydrophobic geranylgeranyl chains in a binding pocket, and recycles it back to donor membranes. Based on the identified interactions in the Rab5:GDI complex at the membrane and in cytoplasm, a scheme of the membrane extraction process was suggested. First, approaching GDI was found to contact the G domain switch regions of membrane-bound, tilted Rab5. Subsequently, GDI re-oriented, thereby establishing contacts to the Rab5 HVR and simultaneously bringing the GDI prenyl binding pocket in close proximity to the membrane surface. Interactions between the Rab5 HVR and GDI turned out to be of great importance for the orientation and binding of the G domain to GDI and thus, for the overall complex stability. Hydrophobic patches were identified which enclose the binding pocket and guided the geranylgeranyl chains into the cavity. In a last step, the tightly bound Rab5:GDI complex diffused from the membrane. Rab5 dysfunctions due to mutations or pathogens cause a disturbance of endocytic transport with enormous consequences for cellular recycling and degradation processes. This thesis provides a deep understanding of Rab5 dynamics, lipid- and protein-interactions in intact cells. This lays the foundation for better insights into distorted interactions and mechanisms in infected or mutated cells. Thus, residues predicted to be essential for interactions with certain effectors could be specifically mutated to influence signaling. Furthermore, the observed nucleotide-dependent Rab5 monomer orientations provide a potential drug target in order to cure Rab5-related dysfunctions.

Der zelluläre Transport umfasst räumlich getrennte Organellen, die durch ein differenziertes vesikuläres System miteinander verbunden sind. Vesikel von der Plasmamembran werden zunächst zu frühen Endosomen transportiert. Diese dienen als Sortierstationen, die ihre Fracht entweder in das trans-Golgi-Netzwerk, über späte Endosomen in Lysosomen zum Abbau oder zurück an die Plasmamembran zur Wiederverwertung weiterleiten. Die membrangebundene kleine GTPase Rab5 ist der Hauptregulator endozytotischer Vorgänge und kontrolliert, unter anderem, den vesikulären Transport zwischen der Plasmamembran und den frühen Endosomen, die Fusion von frühen Endosomen und Vorgänge in der Phagozytose. Aufgrund seiner Funktion in der Endozytose bestimmt Rab5 die Transportvorgänge aufgenommener Fracht, wie z.B. von Oberflächenrezeptoren, und ist damit indirekt an einer Vielzahl von Infektionskrankheiten, neuronalen Störungen und Tumorerkrankungen beteiligt. Wie alle kleinen GTPasen besteht Rab5 aus einer strukturell konservierten, katalytisch aktiven GTPase (G)-Domäne, welche Guanosindi- oder Guanosintriphosphat (GDP/GTP) bindet und GTP mit einer geringen intrinsischen Rate hydrolysiert. Rab5 dient als molekularer Schalter, der zwischen der inaktiven, GDP-gebundenen und der aktiven, GTP-gebundenen Form wechselt, wobei Letztere Effektorproteine an die Membran rekrutiert. Die G-Domäne ist mit der Membran über eine lange Cterminale hypervariable Region (HVR) verknüpft. Zwei kovalent gebundene Geranylgeranylgruppen am äußeren Rab5 C-Terminus ermöglichen eine Verankerung in der Membran. Während Rab5(GTP) ausschließlich an der Membran lokalisiert ist, pendelt Rab5(GDP) in Abhängigkeit von RabGDI (im Folgenden GDI) zwischen der Membranoberfläche und dem Zytoplasma. Bis heute beinhalten Rab5 Kristallstrukturen lediglich Aminosäurereste der G-Domäne, während die flexiblen N- und C-Termini fehlen. Die Synthese von Rab5 für experimentelle Untersuchungen wird durch die post-translatorische Modifizierung mit Geranylgeranylgruppen erschwert. Diese Aspekte machen die Vorbereitung und Durchführung von Laborexperimenten sehr aufwendig, kostspielig und zeitintensiv. Angesichts der experimentellen Herausforderungen stellt die Charakterisierung von Rab5 mittels computergestützter Studien eine vielversprechende alternative Strategie dar. In der vorliegenden Arbeit wurden Homologiemodellierung und Molekulardynamik-Simulationen genutzt, um vollständige Rab5(GDP) und Rab5(GTP) Modelle zu generieren und diese hinsichtlich ihrer Dynamik und Interaktionen mit Membranen und Proteinen zu untersuchen. Im Gegensatz zu den ungeladenen Membranmodellen, orientierte sich die monomere G-Domäne in Abhängigkeit von dem gebundenen Nukleotid in der geladenen Membran hin zur Membranoberfläche. Die für die Erkennung durch Bindungspartner essenziellen Switchregionen nahmen in der GDP-gebundenen Form vorrangig eine abgeschirmte Konformation an. Die GTP-gebundene Form hingegen war hauptsächlich mit vollständig zugänglichen Switchregionen auf der membranabgewandten Seite des Proteins assoziiert. Das Kippen der G-Domäne ist eine notwendige Voraussetzung für die Rekrutierung und das Binden von Effektorproteinen durch die kleine GTPase in großer Nähe zur Membran. Die Umorientierung der G-Domäne wurde hauptsächlich durch elektrostatische Interaktionen zwischen den basischen Resten der HVR und dem negativ geladenen PI(3)P Signallipid der Membran des frühen Endosoms gesteuert. Es zeigte sich, dass diese Interaktionen die laterale Diffusion des Peptides verlangsamten. Die mit dem Transfer des Membranankers aus der Membran assoziierte Gibbs-Energie war in der geladenen Membran deutlich erhöht. Durch den Einsatz von coarse-grained Simulationen wurde eine Rekrutierung von PI(3)P an die HVR beobachtet, welche der Ausbildung von räumlich abgegrenzten, mit Rab5 und PI(3)P angereicherten, Signalplattformen dient. Die Fähigkeit von Rab5 zur Dimerisierung wird in der Fachliteratur kontrovers diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Dimerisierung von membrangebundenem Rab5(GDP) und Rab5(GTP) in Komplexe mit geringer Affinität über unterschiedliche Dimerisierungsflächen beobachtet. In Rab5(GDP) fand die Dimerisierung bevorzugt über die Switch I -Faltblätter statt, während die Switchregion II größtenteils zugänglich blieb. Im Gegensatz dazu, trugen die -Helices der Switchregion II vorrangig zu der Dimerisierung von Rab5(GTP) bei. Basierend auf den an der Dimerisierung beteiligten Proteinoberflächen waren GDP-gebundene Rab5 Dimere stabiler als GTP-gebundene. Die Dimerisierung von Rab5(GDP) bei hohen Proteinkonzentrationen diente der Anlage eines inaktiven, membranassoziierten Reservoirs von sofort verfügbaren Rab5 Molekülen. Im Fall von Rab5(GTP) Dimeren wies zumindest ein Monomer eine gegenüber dem unkomplexierten Rab5 verbesserte Erreichbarkeit der Switchregionen auf. Dies geschah durch eine exponiertere Lage abseits der Membranöberfläche. Die jeweilige Präferenz eines Rab5 Aktivierungszustandes für unterschiedliche Dimerisierungsflächen spiegelte ihre Rolle in spezifischen Protein-Protein-Interaktionen wider. Aminosäuren in den Switchregionen, welche der Erkennung von Effektorproteinen dienen, waren in den Rab5(GTP) Dimeren weitgehend zugänglich. GDI ist ein wichtiger Interaktionspartner von Rab5(GDP). Es zeigte sich, dass Rab5(GDP)-GDI Interaktionen vorrangig über die Rab5 Switchregion II stattfanden, welche kaum an der Dimerisierung beteiligt waren. GDI extrahiert Rab5(GDP) aus der Membran in das Zytoplasma, stabilisiert den löslichen Komplex durch die Aufnahme der hydrophoben Geranylgeranylgruppen in eine Bindungstasche und transferiert Rab5 zurück auf eingehende Vesikel. Basierend auf den identifizierten Interaktionen im membrangebundenen und löslichen Rab5:GDI Komplex wurde ein Schema des Membranextraktionsmechanismus entworfen. Sich näherndes GDI kontaktierte zunächst die Switchregionen der G-Domain des membrangebundenen Rab5. GDI richtete sich anschließend aus, was mit der Ausbildung von Kontakten zur Rab5 HVR einherging und gleichzeitig die Prenylbindungstasche in der Nähe der Membranoberfläche positionierte. Die Interaktionen zwischen der Rab5 HVR und GDI waren dabei von großer Bedeutung für die Orientierung und das Binden der G-Domäne an GDI und damit für die Stabilität des gesamten Komplexes. Hydrophobe Bereiche entlang der Bindungstasche, welche die Geranylgeranylgruppen in die Tasche leiteten, wurden identifiziert. In einem letzten Schritt diffundierte der mit starker Affinität bindende Rab5:GDI Komplex von der Membranoberfläche weg. Störungen der Rab5 Funktion aufgrund von Mutationen oder Pathogenen verursachen eine Beeinträchtigung der endozytotischen Transportvorgänge mit enormen Auswirkungen auf die zelluläre Wiederverwertungs- und Abbaumaschinerie. Die vorliegende Arbeit ermöglicht tiefgreifende Einblicke in die Dynamiken von Rab5 und dessen Interaktionen mit Lipiden und Proteinen in intakten Zellen. Dies liefert die Voraussetzungen für das Verständnis gestörter Interaktionen und Mechanismen in infizierten oder mutierten Zellen. Ausgehend von der Vorhersage wichtiger Aminosäurereste für Interaktionen mit bestimmten Effektoren, können diese gezielt mutiert werden, um Signalkaskaden zu beeinflussen. Zudem stellen die beobachteten nukleotidabhängigen Rab5 Monomer Orientierungen einen möglichen Ansatzpunkt für die Entwicklung von Inhibitoren und Arzneimitteln zur Bekämpfung von mit Rab5 assoziierten Funktionsstörungen dar.