Evaluierung pharmakokinetischer und toxikologischer Determinaten von Nanopartikeln mittels in vivo Neuroimaging

Abstract

The Blood-Brain Barrier (BBB) is a physiological barrier between blood and central nervous system (CNS). The specific features of the capillaries protect the brain from pathogens and toxins. Unfortunately, medicines and pharmacologic active substances for the treatment of many CNS disorders can usually not pass the BBB. For many diseases of the brain (like Parkinson, Alzheimer, Multiple sclerosis) there are no appropriate therapies. Therefore, polymer nanoparticles become more and more important for the industry as a drug carrier-system. To use nanoparticles for the delivery of drugs into the brain they have to fulfil important criteria: easy production and stocking, optimized system characteristics to bind drugs and to overcome the BBB, and no toxic reactions after application. In the literature, there is evidence that nanoparticle based on polybutylcyanoacrylat (PBCA) may satisfy these requirements. This was the motivation underlying the current project, i.e. modifying and optimizing nanoparticles with respect to their ability to cross the BBB and their distribution within the CNS tissue. The preparation of the particles was performed by miniemulsions polymerisation. This process enables an easy production and modification of PBCA nanoparticles in a short time and with only a few auxiliary supplies. Also we get a high percentage of nanoparticles with narrow particle size distribution by using this miniemulsions polymerisation. At the beginning of these studies parameters of production (duration of ultrasonication, polymerisation time, and the pH) were varied to obtain ideal particles. These results provide the basis for the next step of modifying the surface characteristics (surfactant, particle size and zeta potential) to enhance BBB penetration. By use of In vivo Confocal Neuroimaging (ICON) the ability of the particles to overcome the blood-retina barrier (BRB), as a model of the BBB, was studied for the first time in living animals in real time. The use of the BRB as an ideal model of the BBB could be demonstrated with the current experiments. The analysis of the surface characteristics of the PBCA nanoparticles shows a significant influence of surfactant on the transition across the BBB. Particle size (up to a diameter of approximately 500 nm) and zeta potential (from -51mV to +20mV) did not have any influence. All modification use non-ionic and anionic tensids individually enhanced transition to the brain but a combination of non-ionic and anionic surfactants prevent crossing. In contrast to the common opinion that small and negative nanoparticles are better for transition in our current experiments also very large PBCA nanoparticles with positive zeta potential crossed the BBB. The transition across the BBB took not even 60 seconds and nanoparticles were found within retina cells. A possible mechanism could be a manipulation of tight junctions by nanoparticles. PBCA nanoparticles do not induce neuronal death in pharmacologically effective concentrations in vivo, even when coated with surfactants which reveal some reduction of viability in cell culture test systems. These particles seem to be a good tool for drug delivery into the CNS. PBCA nanoparticles could be loaded with a pharmacologically active substance and showed an analgesic effect in the hot plate test. These new findings are important for the development of treatments for diseases of the central nervous system.

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bildet aufgrund ihrer Besonderheiten im Aufbau der Kapillaren, u.a. mit den über Tight Junctions fest verbunden Endothelzellen, eine kaum überwindbare Stoffbarriere. Aufgrund dieses Schutzwalles können die meisten Erkrankungen des zentralen Nervensystems nicht zufriedenstellend behandelt werden, weil die Medikamente die BHS nicht überwinden können. Der demographische Wandel mit dem vermehrten Auftreten altersassoziierter Erkrankungen steigert das Interesse an partikulären Systemen, wie Polymernanopartikel, als Wirkstoffträger zum Überwinden der BHS nach dem Trojanischen Pferd-Prinzip. Zu diesem Zweck müssen die Nanopartikel einige wichtige Kriterien erfüllen: Einfache Herstellung & Lagerung, optimierte Systemeigenschaften in Hinblick auf Wirkstoffbindung und Transport über die BHS und toxikologische Unbedenklichkeit. Nanopartikel aus Butylcyanoacrylat könnten diesen Anforderungen entsprechen. Deshalb wurden in dieser Studie modifizierte Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikel (PBCA-NP) im Hinblick auf Hirngängigkeit, Toxizität und als Wirkstoffträger untersucht. Mit dem Miniemulsionsprozess ist es möglich, gezielt und einfach PBCA-NP mit nur einer geringen Anzahl an Hilfsstoffen in kurzer Zeit herzustellen. Dieser Herstellungsprozess erzielt eine hohe Ausbeute an Partikeln mit gutem Massenverhältnis Tensid/ Monomer und schmaler Partikelgrößenverteilung. Die zu Beginn dieser Studie durchgeführten Experimente zum Einfluss der Polymerisationsparameter (Ultraschalldauer, Polymerisationszeit & pH-Wert) auf die Beschaffenheit der Partikel erlaubte die Modifikation der Partikel (Oberflächenbeschaffenheit, Größe & Zetapotential) in Hinblick für die BHS-Gängigkeit. Mit dem live imaging Verfahren „In vivo Confocal Neuroimaging“ (ICON) konnte der Übertritt und die Verteilung der intravenös verabreichten PBCA-NP an der Blut-Retina-Schranke (BRS) als Modell für die BHS im lebenden Tier in Echtzeit untersucht werden. Dies ist ein enormer Vorteil gegenüber herkömmlichen in vivo oder ex vitro Verfahren. Die Nutzung der BRS als ideales Modellsystem zur Untersuchung der BHS wurde durch die hier gewonnenen Daten belegt. Die Analyse der Eigenschaften und Beschaffenheit der PBCA-NP für die BHS-Passage zeigte eine signifikante Beeinflussung durch die für die Modifikation eingesetzten Tenside aber nicht direkt durch Größe (bis ca. 500nm) oder Zetapotential (von -51mV bis +20mV). Die gestesteten anionischen und nichtionische Tenside begünstigen den Übertritt der PBCA-NP über die BHS, wohingegen eine Kopplung der anionischen mit den nichtionischen Tensiden dies verhinderte. Im Gegensatz zur in der Literatur vorherrschenden Meinung „je kleiner und negativer, desto besser der Übertritt“ überquerten auch große PBCA-NP mit positiven Zetapotential die BHS. Die Überwindung der BHS durch die PBCA-NP erfolgte sehr schnell, innerhalb von 60s war eine zelluläre Verteilung im Gewebe erkennbar. Ein möglicher Mechanismus dafür wäre nach meiner Untersuchung die Beeinflussung der Tight Junctions durch die Nanopartikel. Die Untersuchungen zur Toxizität zeigten in vitro und in vivo keine aus der Applikation von PBCANanopartikel resultierenden toxischen Effekte in pharmakologisch relevanten Konzentrationen. Damit erfüllen die PBCA-NP die Kriterien für die Nutzung als Arzneimittelträgersysteme. Die Wirkstoffbindung an den Partikel und die resultierende analgetische Wirkung, gezeigt durch die Erhöhung der Schmerzschwelle im Hot plate Test, untermauern dies. Die Ergebnisse sind aufgrund der Ähnlichkeit der Retina der Ratte und des Menschen gut übertragbar und sind somit wertvoll für die pharmazeutische Industrie zur Entwicklung wirksamer Medikamente für Erkrankungen des Zentralen Nervensystems.