Characterization of novel RASopathy mouse models with conditional mutations in GABAergic interneurons

Abstract

The Rat sarcoma (RAS)-extracellular signal-regulated kinase (ERK) cascade is a highly conserved signaling pathway crucial for regulating key cellular processes required for mammalian development, including growth, proliferation, differentiation, and survival. Germline mutations in components or regulators of the RAS-ERK pathway lead to a class of developmental disorders collectively known as RASopathies, which affect approximately 1 in 1000 individuals. Patients with RASopathies have an increased likelihood of experiencing neuropsychological impairments, including cognitive, emotional, and social difficulties. Increasing evidence suggests that specific neuronal populations, such as excitatory neurons and inhibitory interneurons, may differentially contribute to these neurobehavioral deficits. To investigate the role of interneurons in RASopathy-associated behavioral phenotypes, a conditional mouse line was established expressing the BrafQ241R gain-of-function mutation (the murine equivalent of BRAFQ257R, a mutation commonly observed in Cardio-facio-cutaneous syndrome) specifically in forebrain GABAergic interneurons (BrafQ241Rfloxed/wt-Dlx5/6Cre/+, referred to as DBrafQ241R/+ mice). Behavioral characterization revealed a pronounced increase in anxiety-like behavior across multiple tasks, reduced spatial recognition (object location task), deficits in working memory (Y-maze test), and impaired cognitive flexibility (Morris water maze reversal). Additionally, DBrafQ241R/+ mice showed alterations in social behavior, characterized by increased sociability but impaired social recognition memory in the three-chamber social test. Histological and electrophysiological analyses revealed, respectively, a significantly increased number of somatostatin-positive interneurons in the dorsal hilus and enhanced long-term potentiation (LTP) in the dorsal dentate gyrus (dDG). These findings motivated the exploration of a potential involvement of this hippocampal subregion in the observed behavioral alterations. Indeed, chronic chemogenetic inhibition of dDG interneurons selectively rescued the social memory deficits in DBrafQ241R/+ mice, without affecting anxiety-like behavior. This result implicates BRAF signaling in dDG interneurons as a critical mediator of social memory dysfunction. In addition, c-Fos mapping following elevated plus maze exposure revealed a reduced activation in the principal cell layers of the dDG, dCA3, and intermediate CA1 subregions of the hippocampus in DBrafQ241R/+ mice. In DBraf+/+ controls, a significant correlation was observed between the time spent in the open arms and dCA3 c-Fos expression, a relationship that was absent in DBrafQ241R/+ mice, suggesting that disrupted dCA3 activity may potentially underlie the increased anxiety phenotype. Together, these findings implicate BRAF signaling in GABAergic interneurons of the dorsal hippocampus as a key contributor to the observed social memory deficits, and point to a potential involvement of altered dorsal hippocampal activity in the increased anxiety-like behavior seen in the mutant mice. Further analysis of DBrafQ241R/+ female mice revealed sex-specific effects of the mutation, including preserved working memory and social behavior, suggesting potential protective mechanisms in female mice. Finally, behavioral phenotyping of two additional mouse lines expressing Noonan Syndrome-associated mutations (K-RasV14I and Ptpn11D61Y) in forebrain interneurons revealed distinct behavioral profiles, highlighting mutation-specific effects and emphasizing the heterogeneous impact of different RASopathy mutations on interneuron function and behavior.

Die RAS-ERK Kaskade ist ein hochkonservierter Signalweg, der für die Regulierung wichtiger zellulärer Prozesse entscheidend ist, die für die Entwicklung von Säugetieren erforderlich sind, darunter Wachstum, Proliferation, Differenzierung und Überleben. Keimbahnmutationen in Komponenten oder Regulatoren des RAS-ERK-Signalwegs führen zu einer Klasse von Entwicklungsstörungen, die zusammenfassend als RASopathien bezeichnet werden und etwa 1 von 1000 Personen betreffen. Patienten mit RASopathien haben ein erhöhtes Risiko für neuropsychologische Beeinträchtigungen, darunter kognitive, emotionale und soziale Schwierigkeiten. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass bestimmte neuronale Populationen, wie exzitatorische Neuronen und inhibitorische Interneuronen, unterschiedlich zu diesen neurobehavioralen Defiziten beitragen können. Um die Rolle von Interneuronen bei RASopathie-assoziierten Verhaltensphänotypen zu untersuchen, wurde eine konditionale Mauslinie etabliert, die die BrafQ241R-Gain-of-Function-Mutation (das murine Äquivalent von BRAFQ257R, einer Mutation, die häufig beim Cardio-facio-kutanen Syndrom beobachtet wird) spezifisch in GABAergen Interneuronen des Vorderhirns exprimiert (BrafQ241Rfloxed/wt-Dlx5/6Cre/+, bezeichnet als DBrafQ241R/+ Mäuse). Die Verhaltenscharakterisierung ergab eine deutliche Zunahme von angstähnlichem Verhalten bei mehreren Aufgaben, eine verminderte räumliche Erkennung (Objektlokalisierungsaufgabe), Defizite im Arbeitsgedächtnis (Y-Labyrinth-Test) und eine beeinträchtigte kognitive Flexibilität (Morris-Wasserlabyrinth-Umkehrung). Darüber hinaus zeigten DBrafQ241R/+-Mäuse Veränderungen im Sozialverhalten, die durch eine erhöhte Geselligkeit, aber ein beeinträchtigtes soziales Erkennungsgedächtnis im Drei-Kammer-Sozialtest gekennzeichnet waren. Histologische und elektrophysiologische Analysen ergaben jeweils eine signifikant erhöhte Anzahl von Somatostatin-positiven Interneuronen im dorsalen Hilus und eine verstärkte Langzeitpotenzierung (LTP) im dorsalen Gyrus dentatus (dDG). Diese Ergebnisse motivierten die Untersuchung einer möglichen Beteiligung dieser Hippocampus-Subregion an den beobachteten Verhaltensänderungen. Tatsächlich konnte durch chronische chemogenetische Hemmung der dDG-Interneuronen das soziale Gedächtnisdefizit bei DBrafQ241R/+ Mäusen selektiv behoben werden, ohne das angstähnliche Verhalten zu beeinflussen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die BRAF-Signalübertragung in dDG-Interneuronen ein entscheidender Mediator der sozialen Gedächtnisstörung ist. Darüber hinaus zeigte die c-Fos-Kartierung nach der Exposition im erhöhten Labyrinth eine verminderte Aktivierung in den Hauptzellschichten des dDG, dCA3 und den intermediären CA1-Subregionen des Hippocampus bei DBrafQ241R/+ Mäusen. Bei den DBraf+/+ Kontrollen wurde eine signifikante Korrelation zwischen der in den offenen Armen verbrachten Zeit und der c-Fos-Expression in dCA3 beobachtet, eine Beziehung, die bei DBrafQ241R/+ Mäusen nicht vorhanden war, was darauf hindeutet, dass eine gestörte dCA3-Aktivität möglicherweise dem erhöhten Angstphänotyp zugrunde liegt. Zusammen genommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die BRAF-Signalübertragung in den GABAergen Interneuronen des dorsalen Hippocampus einen wesentlichen Beitrag zu den beobachteten Defiziten im sozialen Gedächtnis leistet und dass eine veränderte Aktivität des dorsalen Hippocampus möglicherweise an dem erhöhten angstähnlichen Verhalten der mutierten Mäuse beteiligt ist. Eine weitere Analyse von DBrafQ241R/+ weiblichen Mäusen ergab geschlechtsspezifische Auswirkungen der Mutation, darunter ein erhaltenes Arbeitsgedächtnis und Sozialverhalten, was auf mögliche Schutzmechanismen bei weiblichen Mäusen hindeutet. Schließlich ergab die Verhaltensphänotypisierung von zwei weiteren Mauslinien, die Noonan-Syndrom-assoziierte Mutationen (K-RasV14I und Ptpn11D61Y) in Interneuronen des Vorderhirns exprimieren, unterschiedliche Verhaltensprofile, was mutationsspezifische Effekte hervorhebt und die heterogene Auswirkung verschiedener RASopathie-Mutationen auf die Interneuronfunktion und das Verhalten unterstreicht.