Peripheral biochemical changes in major depressive disorder using breathomics analysis : new insights into molecular psychiatry

Abstract

Major depressive disorder (MDD) is one of the most prevalent and disabling psychiatric illnesses worldwide, contributing significantly to the global burden of disease. Despite extensive research, no single biological mechanism fully explains its heterogeneity. Moreover, the clinical management of MDD remains challenging due to limited therapeutic success, imprecise subjective diagnostic criteria, and an incomplete understanding of the underlying molecular pathology. The metabolome represents the integrated output of complex interactions among the genome, transcriptome, proteome, microbiome, and environmental exposome. From this system-level perspective, we hypothesized that breath-based metabolomics, or breathomics, could non-invasively capture distinct, multi-parametric metabolic signatures associated with the heterogeneous pathophysiology of MDD. The primary aim of this study was to investigate the potential and limitations of the breath gas analysis in identifying known alterations in metabolic pathways implicated in MDD and to support the development of an objective, non-invasive, systems-level molecular diagnostic test, thereby contributing to the advancement of precision psychiatry. Particular attention was paid to post-awakening metabolite dynamics, given the critical role of this time window in activating stress-responsive biological systems such as hypothalamic–pituitary–adrenal axis. A total of 153 breath samples were collected at awakening, 30- and 60-minutes post awakening from 26 patients with MDD and 25 HCs. Exhaled volatile organic compounds (VOCs) were profiled using the proton transfer reaction mass spectrometry (PTR-MS). Candidate metabolites were initially preselected using the Wilcoxon tests and Student’s t-tests. Metabolomic pathway analysis and hierarchical clustering analysis (HCA) were then performed to group significant VOCs according to shared temporal dynamics and biological functions. Neighborhood component analysis was applied to rank VOCs according to their importance in classifying MDD and HCs. Forward feature selection was used as an iterative procedure to build multivariable predictive models and identify potential breathprint combinations. Four machine learning models: support vector machine (SVM), kernel SVM (K-SVM), Naïve Bayes (NB), and logistic regression (LR), were employed to evaluate the classification performance of individual VOCs and breathprints. Model accuracy was validated through Bootstrapped receiver operating characteristics (ROC) analysis. In total, 26 exhaled VOCs were significantly altered in MDD patients compared to HCs. These VOCs were enriched in five key metabolic pathways, including valine, leucine and isoleucine leucine biosynthesis (p = 5.50 10-4), pyruvate metabolism (p = 7.97 10-4), glycolysis and gluconeogenesis (p = 0.0015), nicotinate and nicotinamide metabolism (p = 0.005) and valine, leucine and isoleucine degradation (p = 0.005). HCA revealed distinct VOC clusters based on their biological functions, reflecting the interaction between host metabolome, exposome, and microbiome. Notably, VOCs of microbial origin exhibited the most pronounced alterations through various fermentation and metabolic pathways. Moreover, the combination of methylpyridine, isoprene, butylamine at their most significant awakening response times represents the most promising 3-variable breathprint across all models (AUC > 0.85, Sensitivity > 0.80, Specificity > 0.85). The addition of trimethylamine further improved model performance, while expanding to five-marker signatures by incorporating propionic acid or benzene further enhanced specificity, supporting their utility for phenotype-specific diagnostics. Furthermore, substituting components of the core breathprint VOCs with similar biological functions yielded comparable high diagnostic performance, suggesting metabolic redundancy, and offering flexibility in breathprint design. This study provides proof-of-concept that breathomics offers novel insights into the peripheral biochemical alterations associated with MDD, and holds strong potential for developing robust, non-invasive molecular breath signatures capable of distinguishing MDD from HCs with clinically meaningful accuracy. By capturing the multifaceted metabolic alterations underlying MDD and reflecting the complex interactions between host metabolome, gut microbiome and exposome, breathomics supports systems-level diagnostics and aligns with the goals of precision medicine in psychiatry. Notably, the identified breath biomarkers and associated pathways demonstrated strong concordance with findings from previous metabolomics studies using other biomatrices, further reinforcing their biological validity and translational relevance.

Die Major Depression (MD) zählt zu den weltweit häufigsten und belastendsten psychiatrischen Erkrankungen und trägt maßgeblich zur globalen Krankheitslast bei. Trotz intensiver Forschung konnte bisher kein einzelner biologischer Mechanismus vollständig die Heterogenität der Erkrankung erklären. Die klinische Versorgung von Patienten mit MD bleibt zudem eine Herausforderung – bedingt durch den begrenzten therapeutischen Erfolg, subjektive und unscharfe Diagnostikkriterien sowie ein unvollständiges Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Pathophysiologie. Das Metabolom stellt das integrierte Endprodukt komplexer Wechselwirkungen zwischen Genom, Transkriptom, Proteom, Mikrobiom und Umwelt (Exposom) dar. Aus dieser systemischen Perspektive heraus wurde die Studienhypothese aufgestellt, dass die atembasierte Metabolomik („Breathomics“) in der Lage ist, nicht-invasiv spezifische, multiparametrische metabolische Signaturen zu erfassen, die mit der heterogenen Pathophysiologie der MD assoziiert sind. Ziel dieser Studie war es, das Potenzial und die Grenzen der Atemgasanalyse bei der Identifikation bekannter metabolischer Veränderungen bei MD zu untersuchen – mit dem langfristigen Ziel, einen objektiven, nicht-invasiven, molekularbasierten Atemtest zur Diagnose von MD zu entwickeln und damit zur Weiterentwicklung einer personalisierten, präzisionsmedizinischen Psychiatrie beizutragen. Ein besonderer Fokus lag auf der Analyse der zeitlichen Dynamik flüchtiger Metaboliten im Zeitraum vom Aufwachen bis 60 Minuten danach, da diese Phase als kritisch für die Aktivierung stressreaktiver biologischer Systeme wie der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA-Axis) gilt. Insgesamt wurden 153 Atemproben zu drei Zeitpunkten (Aufwachen, 30 und 60 Minuten danach) von 26 Patienten mit MD und 25 gesunden Kontrollpersonen erhoben. Die Analyse flüchtiger organischer Verbindungen (FOVs, engl. VOCs – volatile organic compounds) erfolgte mittels Protonen Transfer Reaktions-Massenspektrometrie (PTR-MS). Die Identifikation statistisch signifikanter VOCs erfolgte mittels Wilcoxon-Tests und Student t-Tests. Eine hierarchische Clusteranalyse (HCA) und eine Metabolom-Pfadweganalyse dienten der funktionellen Gruppierung signifikanter VOCs nach zeitlicher Dynamik und biologischer Relevanz. Zur Bewertung der diagnostischen Aussagekraft einzelner VOCs wurde eine Merkmalsgewichtung mittels Nachbarschaftskomponentenanalyse (NKA) durchgeführt. Die schrittweise Merkmalsauswahl (Forward feature Selection) diente zur Identifikation optimaler VOC-Kombinationen („Breathprints“). Vier maschinelle Lernverfahren kamen zum Einsatz: Support-Vektor-Maschine (SVM), Kernel-SVM (nichtlinear), Naive-Bayes-Klassifikator (NB) und logistische Regression (LR). Die Modellgüte wurde mithilfe von bootstrapping-basierten ROC-Kurvenanalysen evaluiert. Insgesamt wurden 26 VOCs identifiziert, die bei MD-Patienten signifikant verändert waren. Diese Metaboliten waren angereichert in fünf biologischen Pfadwegen: Valin-, Leucin- und Isoleucin-Biosynthese (p = 5,50 × 10⁻⁴), Pyruvatstoffwechsel (p = 7,97 × 10⁻⁴), Glykolyse und Glukoneogenese (p = 0,0015), Nikotinat- und Nikotinamidstoffwechsel (p = 0,005) sowie Abbau von Valin, Leucin und Isoleucin (p = 0,005). Die HCA zeigte funktionell unterschiedliche Cluster, die das Zusammenspiel von Wirtsmetabolom, Mikrobiom und Umwelt-Exposom widerspiegelten. Besonders VOCs mikrobiellen Ursprungs zeigten deutliche Veränderungen. Eine Kombination aus Methylpyridin, Isopren und Butylamin – jeweils zu ihrem diagnostisch optimalen Messzeitpunkt – erwies sich als leistungsfähiges 3-Marker-Breathprint mit hoher diagnostischer Genauigkeit (AUC > 0,85, Sensitivität > 0,80, Spezifität > 0,85). Die Hinzunahme von Trimethylamin verbesserte die Modellleistung leicht; eine Erweiterung auf fünf Marker durch Propionsäure oder Benzol erhöhte die Spezifität weiter und ermöglichte eine differenziertere Phänotypisierung von MD. Der Austausch von VOCs im Haupt-Breathprint durch funktionell ähnliche Verbindungen führte zu vergleichbarer Klassifikationsgenauigkeit – was auf metabolische Redundanz hinweist und die Flexibilität bei der Gestaltung diagnostischer Tests erhöht. Diese Studie liefert einen Machbarkeitsnachweis dafür, dass Breathomics neue Einblicke in periphere biochemische Veränderungen bei MD ermöglicht und das Potenzial für die Entwicklung robuster, nicht-invasiver molekularer Atemsignaturen mit klinisch relevanter diagnostischer Genauigkeit bietet. Durch die Erfassung vielschichtiger metabolischer Veränderungen und die Berücksichtigung von Wirt-Mikrobiom-Exposom-Interaktionen leistet Breathomics einen Beitrag zur systemmedizinischen Diagnostik und fördert die Ziele der Präzisionspsychiatrie. Die identifizierten VOCs und deren zugehörige Stoffwechselwege stimmen mit Ergebnissen früherer Metabolomik-Studien aus anderen biologischen Matrices überein und bestätigen ihre biologische Relevanz und ihr translationales Potenzial.