Advanced technologies and applications based on Polydimethylsiloxane (PDMS)

Abstract

Diese Dissertation präsentiert Forschungsergebnisse im Bereich der mikrofluidischen Chips und ihre Anwendungen im biomedizinischen Bereich. Grundlage für diese Chips ist dabei das vielseitige Material Polydimethylsiloxan (PDMS). PDMS ist bekannt für seine Transparenz, Gasdurchlässigkeit, Biokompatibilität und Dehnbarkeit. Aus der Kombination von PDMS mit anderen Polymeren und Glas, lassen sich maßgeschneiderte Lösungen für Gewebetechnik und Einzelzellexperimente herleiten. Im Gegensatz dazu bieten handelsübliche Mikrofluidikgeräte oft nicht die benötigte dedizierte Anpassungsfähigkeit zur Untersuchung spezieller, hochkomplexer biologischer Fragestellungen. In der vorliegenden Arbeit werden drei mikrofluidische Chips vorgestellt, die jeweils für eine spezifische Anwendung zugeschnitten sind. Erstens, wird eine Struktur mit zwei mikrofluidischen Kanälen, die durch eine poröse Polyester-Membran getrennt sind und speziell für die Anwendung eines Stomach-on-Chip entwickelt wurden, beschrieben. Zur Realisierung dieses Chips wurde eine neuartige Klebebindungstechnik auf Basis von flüssigem PDMS vorgeschlagen, entwickelt und in der vorliegenden Arbeit beschrieben. Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht eine zuverlässige Verbindung von beliebigem porösem Material mit PDMS. Dies eröffnet weitreichende Möglichkeiten für die Herstellung von mehrschichtigen Chips aus verschiedenen Materialien. Darüber hinaus ermöglicht diese neuartige Klebebindungstechnik die Steuerung der Haftfestigkeit und hält den mikrofluidischen Chip unter kontinuierlichen Flussbedingungen über Wochen funktionsfähig. Zudem ist es möglich, den Chip zu zerlegen und die Membran mit kultivierten Zellen für die anschließende Analyse auszustoßen. Als ein Anwendungsfall ist exemplarisch die Kultivierung von Magenkrebszelllinien unter dynamischen Bedingungen durchgeführt worden. Zur weiteren Untersuchung der kultivierten Magenkrebszelllinien ist außerdem ein umfängliches System aus druckgesteuerter Pumpe und Incucyte-Fluoreszenz-Automatenmikroskop entworfen und gebaut worden. Diese Vorrichtung ermöglicht eine geringe Durchflussrate des Zellkulturmediums von 0.5 μl/min und die Detektion der Zellapoptose für chemotherapeutische Medikamentenforschung. Zweitens, wurde eine spezielle 3D-Mikrofluidikstruktur (ImmunoChip) entwickelt. Der Immunochip ermöglicht es Immun-CD4+-T-Zellen zu charakterisieren und ihren Transport zu den von Leishmanien infizierten Makrophagen zu untersuchen. Diese Struktur besteht aus 378 miteinander verbundenen Kanälen. Dafür wurde zunächst ein mikrofluidischer Chip sorgfältig entworfen, um sowohl Makrophagen effektiv von T-Zellen zu trennen, als auch eine kontrollierte Interaktion zwischen diesen Zelltypen zu ermöglichen. Daher wurde in dieser Dissertation eine neuartige, sich in zwei Schritte gliedernde Prozessierungsmethodik entwickelt, um das 3D-hochintegrierte Mikrofluidiksystem mit Nanopräzision zu fertigen. Auf Basis der weichen Lithographie werden zunächst drei "große" Kanäle realisiert und anschließend unter Verwendung des Femtosekunden-Direktschreibprozess extrem feine senkrechte 6 μm×4 μm×30 μm Kanäle hergestellt. Dieses innovative Design dient als ein wichtiges Werkzeug zur Förderung des menschlichen Verständnisses der Immunsignalgebung, ein entscheidender Faktor bei der Behandlung und Heilung zahlreicher Krankheiten. Drittens, wurde in dieser Arbeit ein maßgeschneiderter mikrofluidischer Chip entwickelt, um den Einfluss heterogener Umgebungen auf die Bewegung von Chlamydomonas, einzelnen grünen Mikroalgen-Mikroschwimmern, zu untersuchen. Chlamydomonas verfügen über eine Sehkraft, die es ihnen ermöglicht, phototaktisches Verhalten zu zeigen. D.h. sie reagieren auf Lichtreize und ermitteln eine optimale Umgebung für die Photosynthese. Diese grünen Mikroschwimmer reagieren stark auf die Umgebungsbedingungen und könnten in Zukunft für ökologische Studien von Nutzen sein. Dafür ist es jedoch unerlässlich zunächst ihr Verhalten unter sich verändernden Umgebungen besser zu verstehen. Daher enthält der vorgeschlagene Chip mikrostrukturierte PDMS-Kanäle, die als eine künstliche poröse Umgebung dienen (LabyrinthChip). Der aus PDMS und Glas hergestellte mikrofluidische Chip realisiert verschiedene Konfigurationen von mikrostrukturierten Labyrinthen, die die Untersuchung des Bewegungsverhaltens der Mikroschwimmer ermöglichen. Zylindrische und elliptische Strukturen sind schachbrettartig in der Mitte jedes Kanals angeordnet und stellen Hindernisse für die Mikroschwimmer dar. Etwaige Reflexions- und Transmissionsereignisse der Chlamydomonas verursacht durch diese Hindernisse werden analysiert. Mikrofluidische Chips benötigen Sensoren zur genauen Überwachung des Zustands der Zellkultur innerhalb des Kanals. Dies kann entweder optisch oder elektronisch erfolgen. In dieser Arbeit wurden mehrere solcher Sensoren für eine optimale Überwachung implementiert. Zur Detektion von Krebszellen wird sich etwa die unterschiedliche Sauerstoff- verbrauchsrate im Vergleich zu gesunden Zellen zu Nutze gemacht. Ein Lumineszenzsensor integriert in einen mikrofluidischen Chip ermöglicht so die Messung der in-situ Sauerstoffkonzentration. In dieser Arbeit wurde eine Methodik für Sauerstoffkonzentrationsmessungen in Mikrofluidik-Kanälen vorgeschlagen und die Auslesung untersucht. Des Weiteren wurden transepitheliale Widerstandselektroden (TEER) bestehend aus Gold in einen flexiblen mikrofluidischen Chip implementiert, um die Konfluenz der Zellen zu erfassen. Der gemessene Widerstand steigt 12 Stunden nach Aussaat der Zellen an und bestätigt die Gewebebildung. Die auf das elastische PDMS aufgedampfte Metallstruktur weist Falten auf, die den Widerstand der Elektroden beeinflussen. Erstmals wurde der Einfluss der PDMS-Härte und -Dicke auf die Faltenbildung erforscht. Hervorzuheben ist ebenfalls der durch die Falten ermöglichte Selbstheilungseffekt, der für die Stabilität der Metallelektroden auf elastischem Substrat äußerst vorteilhaft ist. Alle in dieser Arbeit vorgeschlagenen Ansätze stellen neuartige Lösungen im Bereich der Mikrostrukturierung für maßgeschneiderte mikrofluidische Chips mit integrierten Sensoren zur Überwachung im Kanal dar. Die neuartigen Lösungen ermöglichen Erforschung hochkomplexer interdisziplinärer Fragestellungen im Bereich der Biomedizin und können einen wesentlichen Beitrag zu einer besseren Gesundheitsversorgung und Ökologie leisten.

This thesis presents a pioneering exploration into the realm of microfluidic chip development, with a profound emphasis on their applications in the medical domain, leveraging the versatile Polydimethylsiloxane (PDMS) as a core material. PDMS, known for its transparency, gas-permeability, biocompatibility, and stretchability within the silicone group, forms the basis of these cutting-edge micro-sized structures tailored for tissue engineering and single-cell experiments, in combination with other polymers and glass. Since biology is a very complex science, particular biological questions require individ- ual customized solution. Hence, commercial off-the-shelf microfluidic devices, are often incapable to address complex biological questions. First, a structure with two microfluidic channels divided by a porous polyester membrane, designed specifically for Stomach-on-Chip (Gastric Cell culture on-Chip) application, is described. To implement this device, a novel adhesive bonding technique based on liquid PDMS was proposed, developed and described here. Developed technology enables a reliable bonding of any porous material to PDMS, what opens a wide perspectives for multi-material chip fabrication. Moreover, it allow control of the bonding strength and keeps the chip stable under continuous flow conditions over weeks. Furthermore, it is possible to disassemble the chip and extrude the membrane with cultured cells for the following analysis. Gastric NCI cell line were cultured in the proposed microfluidic chip under dynamic conditions. Furthermore, a full custom designed microfluidic system was built around the proposed chips in combination with a pressure-driven pump and Incucyte fluorescence automatic microscope. This setup enables meager cell culture medium flow rate of 0.5 μl/min and detection of the cell death during the chemotherapeutic drug screening. Second, to investigate the immune CD4+ T cells and study their route towards macrophages infected by Leishmania, a dedicated 3D microfluidic structure (ImmunoChip), consisting of 378 interconnected channels was developed in this thesis. Initially, a microfluidic device was meticulously designed with a dual purpose: firstly, to effectively segregate macrophages from T cells, and subsequently, to facilitate controlled interaction between these cell types. This innovative design serves as a crucial tool in advancing human comprehension of immune signaling, a pivotal factor in the treatment and cure of numerous diseases. Therefore, a novel technology was developed for obtaining the 3D highly integrated microfluidic system with nano-precision. The master mold fabrication for PDMS was done in two steps: first, soft lithography for big micro-channels (two channels 100 μm and one 150 μm) and second, femtosecond direct write process for 6 μm × 4 μm × 30 μm perpendicular channels. Also, the bottom side of the ImmunoChip is a 170 μm thick glass slide, which allows for cell monitoring by fluorescence and optical microscopy with high resolution. Third, to study the effect of heterogeneous surroundings on the motion of Chlamydomonas, single-cell green algae microswimmers, a dedicated custom designed microfluidic chip was developed in this work. Chlamydomonas possess an eyesight that enables them to exhibit phototactic behavior, i.e. to react to light stimuli and seek optimal conditions for photosynthesis. These green microswimmers are highly reactive on the environmental conditions and could be beneficial in ecology studies if we understand deeply their behaviour. Therefore, the proposed chip contains microstructured PDMS channels that act as an artificial porous environment (LabyrinthChip). The fabricated microfluidic chip is based on PDMS and glass and implements various configurations of microstructured labyrinths that enables the study of the movement behaviour of the microswimmers. Cylindrical and elliptical structures are arranged in chess-board order in the middle of each channel, posing obstacles for microswimmers to cross. These reflection and transmission events of the Chlamydomonas through the obstacles are recorded and analyzed. Microfluidic chips need sensors to monitor the state of cell culturing inside the channel. This can be done either by optical or electronic means. Several such sensors were implemented in this work. Cancer cells have a different oxygen-consumption rate compared to that of healthy cells. Therefore, a luminescence sensor was built into a microfluidic device to enable in-situ oxygen concentration measurements. This can be potentially used to distinguish between cancerous and healthy cells in the channel. A technological solution how to embed an optical sensor with wireless readout was provided. Additionally, a methodology for oxygen concentration measurements in microfluidic channels is proposed in this work. Furthermore, golden transepithelial resistance electrodes (TEER) were implemented in a flexible microfluidic chip to detect the cells’ confluency. The measured resistance grows in 12 hours after cells’ seeding, which proves the creation of the tissue. The metal structure sputtered on the elastic PDMS possesses wrinkles, which influence the resistance of the electrodes. The wrinkling behaviour of metal thin films on the elastic materials is a potential research field, which could open a new horizons for sensor development. Therefore, meander-shaped elements on thin freestanding PDMS membranes were designed and studied in depth. At first time the influence of the PDMS hardness and thickness on the wrinkle formation was reported. Moreover, wrinkles ensure a self-healing effect, which is highly beneficial for metal electrode stability on elastic substrate. All of the techniques proposed in this thesis provide novel solutions in the field of microstructuring for development of custom-designed microfluidic devices with integrated sensors for monitoring inside the channel. These devices enable interdisciplinary research that helps to gain knowledge and develop tools for better healthcare and a better environment.