Rekombinante Herstellung und biophysikalische Charakterisierung des humanen Parathormon-Rezeptors

Abstract

Humane Rezeptoren für die Peptidhormone Parathormon und Parathormon-related peptide kommen hauptsächlich und in hoher Anzahl im Knochengewebe und der Niere vor. Sie sorgen in diesen Organen für die Parathormon-abhängige Regulierung des Mineralstoffhaushaltes. Darüber hinaus vermittelt der Parathormonrezeptor die parakrine Wirkung des Parathormon-related peptides, die eine entscheidende Rolle im Prozess der endochondralen Knochenbildung spielt. Bereits 1978 konnte der Parathormonrezeptor als G-Protein gekoppelter Rezeptor identifiziert werden. Die Forschung der letzten Jahre auf dem Gebiet der G-Protein gekoppelten Rezeptoren war gekennzeichnet durch die Aufklärung der intrazellulären Signaltransduktionswege, an denen diese Rezeptoren beteiligt sind. Gegenwärtig konzentriert man sich auf die Aufklärung der molekularen Prinzipien der Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand um so ihre physiologische Rolle zu klären. Grosse Anstrengungen werden auch hinsichtlich der strukturellen Aufklärung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren unternommen. Diese strukturelle Aufklärung auf atomarer Basis wird entscheidend zum Verständnis der Ligandenbindung und die an diese gekoppelte Signalweiterleitung in das Zellinnere beitragen. Bisher sind diese Versuche allerdings aufgrund der niedrigen zur Verfügung stehenden Proteinmenge gescheitert. Das primere Ziel dieser Arbeit besteht nun darin, am Beispiel des Parathormonrezeptors Methoden und Protokolle zu etablieren, die den Rezeptor in für die Strukturaufklärung erforderlichen Mengen bereitstellt. Besonders die Entwicklung und Etablierung von Expressionsprotokollen auf prokaryontischer Basis mit der Produktion des Rezeptors als Inclusion bodies und die anschließende Renaturierung des PTH Rezeptors stehen hierbei im Focus. Eine erste biochemische und biophysikalische Charakterisierung soll die Funktionalität des Rezeptors dabei bestätigen.

The type 1 receptor (PTH1R) for parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) is a G protein-coupled receptor that is highly expressed in bone and kidney and mediates in these tissues the PTH-dependent regulation of mineral ion homeostasis. The PTH1R also mediates the paracrine actions of PTHrP, which play a particularly vital role in the process of endochondral bone formation. These important functions, the likely involvement of the PTH1R in certain genetic diseases affecting skeletal development and calcium homeostasis, and the potential utility of PTH in treating osteoporosis have been the driving force behind intense investigations of both the receptor and its peptide ligands. Recent lines of work have led to the identification of constitutively active PTH1Rs in patients with Jansen’s metaphyseal chondrodysplasia, the demonstration of inverse agonism by certain ligand analogs, and the discovery of the PTH-2 receptor subtype that responds to PTH but not PTHrP. As reviewed herein, a detailed exploration of the receptor-ligand interaction process is currently being pursued through the use of sitedirected mutagenesis and photoaffinity cross-linking methods; ultimately, such work could enable the development of novel PTH receptor ligands that have therapeutic value in treating diseases such as osteoporosis and certain forms of hypercalcemia. In this work, we develops methods for recombinat receptor production in Escherichia coli, receptor chromatographic purification and refolding. The focus was the first biophysical characterisation of the receptor-ligand binding.