Untersuchungen zur Interferenz zwischen dem AhR- und dem HIF-1α-Signalweg sowie deren Auswirkungen auf die p53-, ERα- und NFAT-Signalwege in MCF-7-Zellen

Abstract

Brustkrebs ist das häufigste Karzinom bei Frauen. TCDD wirkt karzinogen, kann als lipophile Chemikalie im Fettgewebe der Brust akkumulieren und aktiviert den Transkriptionsfaktor Arylhydrokarbonrezeptor (AhR). TCDD trifft im Mammakarzinom auf heterogen über das Karzinom verteilte hypoxische Bereiche. Der mittlere Sauerstoffpartialdruck ist in Mammakarzinomen im Vergleich zum normalen Brustgewebe verringert (Hypoxie) und aktiviert den Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierter Faktor-1α (HIF-1α). Diese Situation zu simulieren, war das Hauptanliegen der vorliegenden Dissertation. Als Zellmodell kam in dieser Arbeit die humane Brustkrebszelllinie MCF-7 zum Einsatz. In MCF-Zellen wird durch eine gleichzeitige Stimulation mit TCDD (10 nM) und Hypoxie (5 % Sauerstoff) die Aktivierung des AhR-Signalweges nicht verringert. TCDD reduzierte jedoch die HIF-1α-Stabilisierung und -Aktivität unter hypoxischen Bedingungen. Als potentielle Mediatoren der Interferenz zwischen dem AhR- und dem HIF-1α-Signalweg wurde das Protein PHD2 und die Kompetition zwischen Hsp90 und Rack1 untersucht. Die PHD2 konnte durch Expressionanalysen als Vermittler der Interferenz zwischen beiden Signalwegen ausgeschlossen werden. Der HIF-1α-Stabilisator Hsp90 wurde nach gleichzeitiger Stimulation mit TCDD und Hypoxie geringer exprimiert, während die Expression des Proteins Rack1 unverändert blieb. Über die Inhibierung von Rack1 mittels siRNA wurde nach gleichzeitiger Stimulation mit TCDD und Hypoxie die TCDD-vermittelte HIF-1α-Destabilisierung verhindert. Die Kompetition von Hsp90 und Rack1 um HIF-1α vermittelt die Interferenz zwischen dem AhR- und dem HIF-1α-Signalweg. Weiterhin wurden die Auswirkungen einer gleichzeitigen Aktivierung des AhR- und des HIF-1α-Signalweges auf den p53- und Östrogenrezeptor α (ERα)-Signalweg untersucht. Die Reduktion der p53-Aktivität konnte auf eine gesteigerte Aktivität des Erα und die transkriptionelle Regulation von Hdm2 zurückgeführt werden. Die Inhibierung des p53-Zielgenes Dusp5 durch die gleichzeitige Stimulation mit TCDD und Hypoxie sowie durch RNA-Interferenz verhinderte die Dephosphorylierung von ERK1/2 und vermittelte so die Aktivierung von ERα. Die Induktion der ERα-Aktivität konnte durch den MEK1-spezifischen Inhibitor PD98059 verhindert werden. Die Kombination der Inhibierung des p53-Signalweges und der Induktion des ERα-Signalweges stellt einen neuen Mechanismus dar, wie TCDD unter hypoxischen Bedingungen die Weiterentwicklung des Brustkrebses fördern könnte.

Breast cancer is a common cancer in woman. The lipophilic environmental pollutant 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) accumulates in the mammary gland tissue and activates the transcription factor aryl hydrocarbon receptor (AhR). Under physiological conditions the oxygen concentration is reduced in breast carcinoma compared to normal breast tissue (hypoxia). The decreased oxygen is correlated with the increased expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α). The aim of this thesis was to simulate this situation in the human breast cancer cell line MCF-7 and to analyse the AhR and HIF-1α signalling. In MCF-7 cells no significant influence of hypoxia (5% oxygen) on TCDD (10 nM)-mediated activation of AhR signalling was found. TCDD clearly reduced the hypoxia-induced stabilization and activation of HIF-1α in an AhR-dependent manner. The protein PHD2 and the competition of Hsp90 and Rack1 known as main regulator of HIF-1α stabilization were analysed for their role in the interference of AhR and HIF-1α pathway. Expression analysis of PHD2 showed that PHD2 did not influence the TCDD-mediated HIF-1α destabilization and does not control the interference of AhR and HIF-1α pathway. TCDD and hypoxia clearly reduced the expression of Hsp90 whereas Rack1 expression was not significantly changed. Silencing of Rack1 by RNAi prevented the TCDD-mediated destabilization of HIF-1α after simultaneous exposure of TCDD and hypoxia. The competition of Hsp90 and Rack1 for binding to HIF-1α mediated the interference between the AhR and HIF-1α pathway. In addition the consequences of simultaneous activation of AhR and HIF-1α signalling on the activation of the tumor suppressor p53 and estrogen receptor α (ERα) were analysed. Simultaneous exposure to TCDD and hypoxia inhibited p53 expression. Both the direct activation of the ERα and the transcriptional regulation of Hdm2 mediated the inhibition of p53 expression. Silencing of the p53-mediated target gene Dusp5 by simultaneous exposure of TCDD and hypoxia or by RNAi led to increased phosphorylation of ERK1/2. This increase resulted in transactivation of ERα and induction of ERα-mediated transcription. Specificity of ERαtransactivation by ERK1/2 was confirmed by treatment with MAPKK-inhibitor PD98059. The combination of inhibition of functional p53 protein and induction of ERα signalling provide a new mechanism for the operational sequence of TCDD in affecting breast tumor progression.