Untersuchung der Substratspezifität der Carnitin Palmityltransferase 1 und 2 im menschlichen Skelettmuskel für geradzahlige Fettsäuren mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen

Abstract

Die Carnitin Palmityltransferasen 1 und 2 stellen zwei wichtige Enzyme in der Verstoffwechselung von Fettsäure-CoA Estern dar. Es sind zwei verschiedene Proteine, welche auf unterschiedlichen Genen lokalisiert sind. Während die CPT 1 durch mehrere transmembranale Domänen fest in die Mitochondrienmembran integriert ist, zeigt die CPT 2 lediglich eine lockere Assoziation mit dieser. Störungen im CPT-Enzymsystem sind Erkrankungen, welche sich klinisch vielfältig präsentieren können. Während einige Patienten nur eine sehr milde Symptomatik z.B. belastungsabhängige Muskelschmerzen ausprägen, treten bei anderen hypoketotische Hypoglykämien, Rhabdomyolysen, Kardiomyopathien u.a. Symptome auf, die zum Tode führen können. Bisherige Arbeiten über das CPT-Enzymsystem untersuchten dessen Funktion nur selten in menschlicher Skelettmuskulatur und häufig auch nur für wenige in Frage kommende Substrate. Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der jeweiligen maximalen enzymatischen Aktivität, der Affinität und des Hemmverhaltens der CPT 1 und 2 für Fettsäuren mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen. Hierfür wurden beide Proteine zunächst von anderen Acyltransferasen und anschließend durch Ultrazentrifugation und Detergenzienbehandlung voneinander getrennt. Unter in vitro Bedingungen konnten sowohl in der Sediment- (CPT 1) als auch in der Überstandfraktion (CPT 2) die höchsten enzymatischen Aktivitäten für kurz- und mittelkettige Fettsäuren bestimmt werden, allerdings waren hierfür teilweise unphysiologisch hohe Substratkonzentrationen erforderlich. Die stärksten Affinitäten konnten für längerkettige Fettsäuren bestimmt werden, wobei hier der Km-Wert in der Überstandfraktion (CPT2) für das C-12 Substrat Lauryl-CoA eine auffällige Abweichung von dieser Tendenz darstellt. Handelt es sich hierbei vielleicht um eine, durch Detergenzbehandlung und Ultrazentrifugation freigesetzte bzw. aktivierte eigenständige C-12 Transferaseaktivität? Hinsichtlich der Hemmbarkeit der Enzyme durch die eingesetzten Fettsäuren in Konzentrationen über dem jeweiligen Substratoptimum konnten deutliche Unterschiede sowohl zwischen den Fraktionen als auch zwischen den jeweiligen Substraten beobachtet werden. Langkettige Fettsäuren hemmen die Aktivitäten von Acyl-CoA Transferasen bei niedrigeren Konzentrationen als kurzkettige Acyl-CoA Ester.

Both enzymes, CPT 1 and CPT 2, play an important role in metabolization of fatty acids. They are different proteins, localized on different genes. While CPT 1 is integrated in the mitochondrial membrane by transmembranal domains, CPT 2 is only in lose association. Disorders of the CPT enzyme system are diseases, able to vary in clinical symptoms. While some patients only develope mild symptoms, for example stress induced muscle pain, also hypocetotic hypoglycaemia, rhabdomyolysis, cardiac myopathy and other symptoms, leading to death, are possible. Previous studies of the CPT enzyme system rarely examined its function in human skeletal muscle and often only some of the possible substrates were used. Aim of this study was the determination of maximal enzymatic activity, affinity and sensitivity to malonyl-CoA of CPT 1 and CPT 2 for fatty acids with chain length of 8 till 18 carbon atoms. First both proteins were seperated from other transferases. In the next step the isoenzymes CPT 1 and 2 were seperated from each other by ultrazentrifugation and detergent treatment. Both, pellet (CPT 1) and superatant (CPT2) fraction, under in vitro conditiones showing highest enzymatic activities for short and medium/long chain fatty acids. Partially, unphysiological high substrate concentrations were used. Highest affinities were determined for long chain fatty acids, but in the supernatant (CPT 2) the Km constant showed a remarkable deviation with substrate lauroyl-CoA (C:12-CoA) from this tendency. Is this, may be, a new transferase activity with specificity for C-12, activated by detergent treatment and ultrazentrifugation? With regard to substrate inhibiton of the enzymes by fatty acids, used in concentrations over substrate optimum, there were clear differences between the fractions on the one, and the substrates on the other hand. Long chain fatty acids are inhibiting transferase activity at lower concentrations in comparison with medium/long chain fatty acids.