Etablierung eines Drosophila-Modells der Alzheimer Erkrankung zur Analyse von Glutaminylzyklase-vermittelter pyroGlu-Aβ-Bildung und deren Hemmung durch spezifische Inhibitoren

Abstract

N-terminal verkürzte Amyloid-β-Peptide (Aβ) spielen offenbar eine wesentliche Rolle im Verlauf und der Schwere der Alzheimer'schen Demenz (AD). Insbesondere durch Pyroglutamyl-Bildung modifizierte Peptide, denen eine erhöhte Stabilität, beschleunigte Aggregation und Neurotoxizität unterstellt wird, stellen eine Hauptform dar. Für die Entstehung dieser N-terminalen Modifikation werden in neueren Untersuchungen Glutaminylzyklasen (QCs) verantwortlich gemacht, die daher ein potentielles Zielenzym der Wirkstoffentwicklung darstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals anhand des Modellsystems Drosophila melanogaster die Rolle von QC für die Entstehung von AβN3pE untersucht sowie P150/03 als ein Inhibitor der QC getestet. Anhand von Datenbankanalysen konnten Gene für Drosophila -QCs identifiziert werden, die mit CG32412 und CG5976 annotiert sind. Ein Vergleich der Primärstrukturen der QCs weist auf verschiedene subzelluläre Lokalisationen der Enzyme hin. Mittels homologer Expression der cDNAs in S2-Zellen und anschließender Zellfraktionierung und Western-Blot Analyse bzw. immunzytologisch konnte eine mitochondriale Lokalisation von CG5976B sowie die Sezernierung von CG32412 belegt werden. Transgene Drosophila -Linien wurden generiert und charakterisiert, die die Aβ-Spezies Aβ1-42, Aβ3-42 sowie Aβ3-42(E3Q) in Form eines Fusionsproteins mit der TRH-Prä-Pro-Sequenz exprimieren. Die Prozessierung der Peptide konnte in S2-Zellen mittels ELISA und Western-Blot Analyse und in den transgenen Fliegen mittels ELISA verifiziert werden. Erste Behandlungsversuche mit P150/03, einem kompetitiven QC-Inhibitor, führten sowohl zur Verringerung der gesamt- als auch der pyroGlu-Aβ-Konzentration in Aβ 3-42(E3Q) exprimierenden Linien. Im Rahmen der Arbeit wurden erstmals N-terminal verkürzte und pyroGlu-modifizierte Aβ- Peptide in Drosophila exprimiert. Die Ergebnisse stellen eine Grundlage für weitere Modelle dar, die in die Charakterisierung von QC-Inhibitoren eingebunden werden können.

N-terminal truncated β-amyloid peptides play an important role in the pathophysiology of Alzheimer's disease (AD). In particular pyroglutamate modified Aβ-peptides (pyroGlu-Aβ) are abundant and display stability against proteolytical degradation and rapid aggregation. The pyroGlu modification of Aâ is catalyzed by glutaminyl cyclase (QC). Inhibition of QC is a potential therapeutic option for the treatment of AD. Here I show the role of QC in developing AβN3pE using Drosophila melanogaster as model organism and inhibition of QC using agent P150/03. Database mining led to the identification of two genes in Drosophila, which putatively encode QCs, CG32412 and CG5976. Analysis of their primary structure suggests different subcellular localizations. Homologous expression of the corresponding cDNAs in S2 cells, subcellular fractionation and immunochemistry revealed CG32412 as a secreted protein and the export of CG5976 into the mitochondrion. New transgene Drosophila -lines, expressing Aβ, were generated. Expression, processing and secretion of Aβ1-42, Aβ3-42 and Aβ3-42(E3Q) peptides were analyzed using ELISA. Treating the flies with the QC inhibitor P150/03 led to the decrease of both, Aβ- and pyroGlu-Aβ-concentrations in flies expressing Aβ3-42(E3Q). These findings provide an important basis for further investigations and for characterization of more QC inhibitors.